Bonjour tout le monde,

Peut être certaine personne ont rencontré le même problème que moi et pourront m'aider. Je travaille sur de l'ADN environnemental extrait avec le kit DNA plant mini kit de Qiagen. Sur cet ADN je voudrais amplifider le 16s/18s et ITS. Pour le 16s j'ai utilisé les amorces 16s8f (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) et 16s1541r (5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA*-3’) et pour ITS:ITS1 (5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’) et ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC -3’).

Au niveau de concentrations de produits et du thermostat je pense qu'il n'y a pas de problèmes. Le problème que je rencontre est que mes PCRs marche une fois sur deux sans que je sache pourquoi. Mon témoin positif également ne marche pas donc ce ne viendrait pas d'inhibiteur dans mon échantillon. Il pourrait s'agir d'inhibiteur autres (pipette, paillasse?), je ne sais pas trop. AU départ je soupconnais la Taq de n'être pas aassez robuste donc maintenant je prends la taq platinum de invitrogen mais j'ai toujours ces problèmes. La première PCR semble marcher mais les autres ensuite ne marche plus. Peut être que contamine les tubes etc... je ne sais pas.

Si cela vous ait déja arrivé j'aimerais avoir un petit retour d'expérience.

Merci beaucoup

mélanie