Séquençage à très haut débit

[invite0af1b060]

Bonjour tout le monde !
Ca fait longtemps que je n'étais pas venue faire un tour sur le forum...
j'imagine que ce qui concerne la biologie moléculaire ce met dans "biologie".

Alors voilà, j'ai un petit problème.
D'habitude je vois plutôt bien le fonctionnement des techniques, mais là je ne comprends absolument pas le principe de séquençage à très haut débit (et je ne trouve rien sur internet qui m'éclaire assez) et j'ai cru voir qu'il y avait des gens calés par ici...
la technique de mon cours est celle utilisant le séquenceur 454. On parle de PCR en émulsion (PCR ok mais en émulsion ? Et je ne comprends pas non plus le principe des billes... par contre, j'ai compris la fin avec le pyroséquençage...

Si quelqu'un veut bien m'aider, j'apprécierai vraiment...
Merci d'avance et bonne journée à tous

Méli
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[TanguyE]

Bonjour,

En fait c'est assez simple. Les biles se lient à une seule molécule d'ADN grâce à un primer spécifique. Ensuite, ces billes portant une unique copie d'ADN sont mises en émulsion (c'est à dire sous forme de gouttelettes d'huile) avec les réactifs nécessaires à une PCR. Ce qui fait que dans chaque gouttelette, tu amplifie une unique copie d'ADN. Cela permet donc d'avoir plusieurs copies d'une même matrice qui sera séquencée.

[invite0af1b060]

Ok merci !
déjà je comprends mieux comment on procède !
J'imagine que tu peux surement me dire, aussi, ce que signifie "fragmenter l'ADN par nébulisation"... ??
et du coup, je comprends bien qu'on amplifie l'ADN dans chaque puits car il était fixé à une bille qui passe dan sce puits, en revanche, comment fait-on pour conclure ? ok on voit de la lumière dans certains puits et pas dans d'autres, mais que cela signifie-t-il ?
J'avoue etre vraiment perdue avec cette méthode de séquençage... il y a un élément que je ne dois pas saisir ou pas avoir lol...

Merci d'avance si tu peux encore m'aider (tu étais clair et précis)

Méli

[TanguyE]

La nébulisation consiste à former des micro-gouttelettes de liquide, comme ces gouttes sont très petites, l'ADN qui se trouve dans la solution sera découpé et réparti dans chaque goutte formée. Je t'avouerai que je ne maitrise pas trop cette technique

Pour ce qui est du résultat, en fait dans la machine un capteur d'image prends une photo à chaque incorporation de nucléotide dans le milieu. Si le nucléotide est présent, la polymérase l'incorpore et il y a donc production ensuite d'un signal lumineux (principe classique du pyroséquençage). L'enchainement de l'incorporation des nucléotides et la prise d'image à chaque étape permet à la machine de reconstituer la séquence contenue dans chaque puits.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite0af1b060]

Ok super !! merci beaucoup, même énormément !
Si je comprends bien, l'ADN étant très fragmenté, on a un bout de séquence dans chaque puits grâce à chaque bille.
Ensuite on fait la PCR en émulsion, donc sur chaque bille. Et au fur et à mesure de cette PCR par ajout de nucléotide on connait la séquence. A chaque fois on sait qu'elle nucléotide on rajoute ? et ainsi, si à la photo il y a de la lumière, c'est que le nucléotide incorporé à l'instant dans la copie en cours était bien celui qu'on a ajouté dans le milieu ? c'est comme cela qu'on connait l’enchaînement ? parce qu'après tout la lumière dit qu'li y a incorporation, mais il faut forcément connaitre le nucléotide rajouté pour connaitre la séquence, non ?

Enfin, merci beaucoup, même si j'ai peut être encore des bugs, je commence à visualiser la méthode, ça s'éclaircit au fur et à mesure, et grâce à toi

Méli

[TanguyE]

Pour la fragmentation, c'est bien ça.

En fait la PCR en émulsion permet d'amplifier tes bouts de séquences de façon à en avoir plusieurs à séquencer en même temps pour éviter d'éventuelles erreurs ensuite.

Dans un second temps ces billes sont récupérées pour être mises sur la plaque de séquençage. Une fois sur cette plaque, la machine va incorporer des A, puis prendre une photo, puis des T et prendre une photo, puis des C puis prendre une photo et enfin des G puis prendre une photo et ainsi de suite toujours dans le même ordre. Ce qui fait que le programme reconstruit la séquence présente dans un puits de la plaque grâce aux signaux.

[invite0af1b060]

ok super !
j'avais pas pigé qu'il y avait un ordre et le programme et tout et tout lol (j'y connais pas grand chose à tout cela).
je pense avoir compris ! merci beaucoup !
J'arrête vraiment de t’embêter maintenant.
Encore merci, c'est cool

Bonne soirée

Méli

[Cendres]

j'imagine que ce qui concerne la biologie moléculaire ce met dans "biologie".

Méli

Oui, on peut même choisir un préfixe, comme "Biologie Moléculaire". Je l'ai rajouté.

[invite0af1b060]

Salut Cendres !
Ok et merci pour le préfixe, je saurais pour la prochaine fois...

Bon week end


Méli