Purification et extraction des protéines....

[invitefee5b5b5]

Je vous explique ma situation, je suis en deuxieme année de biologie, et j'ai une matière ou je dois crée moi même mon TP de A a Z avec un sujet définit, mon sujet est "Purification et caractérisation des propriétés de réduction des ponts disulfures de la protéine DsbA de la bactérie Neisseria meningitidis", le sujet fais plus peur qu'autre chose, mais bon .

On nous fournit a la base du travail des Cellules d’E. Coli Contenant la protéine DsbA3 avec une séquence contenant une étiquette poly histidine.

je pensais donc faire au prealable un choc osmotique pour recuperer la protéine et ensuite faire un Western Blot, c'est la ou commence mes problèmes car je n'arrive pas a trouver un protocole plutot simple de WB, donc si quelqu'un peut m'aider ca serait gentil.
A la suite de ce WB j'effectue une purification par chromatographie d'affinité sur colonne Ni- NTA, mais je ne sais pas qu'elle volume de protéine mettre dans la colonne..
A la suite de cette purification je pensais realiser un Bradfort sur un extrait brut et purifié car on me demande un rendement de purification.
Ensuite avec l'extrait de protéine purifié, je réalise une réaction avec l'insuline pour caractériser les propriétés de réduction.

Voila bien sur c'est un peu brouillon, mais vu que nous devons travailler en autonomie, c'est assez compliqué d'organiser ses idées, merci de prendre un peu de temps pour essayer de m'aider.
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[invited72ed463]

Bonjour,

As tu tenté ta chance sur le forum de biologie ?
Parce qu'en chimie on ne voit pas les techniques que tu cites ...

Bon courage en tous cas !

[inviteb7fede84]

Transféré en biologie. Pour la modération. Shaddock91

[invitec9f0f895]

Salut

POur casser tes cellules une sonication sera plus efficace. Ensuite ton gène n'est il pas sous promoteur inductible? (par l'IPTG par exemple)? car si c'est le cas, il faut une période d'induction avant le cassage.
Ensuite tu récupère l'extrait brut, un bradford dessus est une bonne idée. Tu purifies, mais tu as interet a fractionner lors de ton élution a l'imidazole sinon ca va etre tres sale.
Apres tu vérifies sur gel dans quelles fractions se trouve ta protéine.
apres tester la réduction de ponts S-S est loin d'etre simple... peut etre par dichroisme circulaire?

YOyo

[A voir en vidéo sur Futura]

[piwi]

La protéine forme elle un homodi(poly)mère? Parce que dans ce cas, tu peux caractériser la réduction des ponts s-s avec un WB sans SDS avec des fractions avant et après réduction. Maintenant, si les ponts s-s sont intrachaine, je suis d'accord que ça ne va pas être forcément de la tarte.

[invitefee5b5b5]

non il n'y a pas de promoteur inductible dessus, juste une queue polyhistine rajoutée pour permettre la purification avec la colonne surement, j'ai regler mon probleme de Western blot mais on me demande d'obtenir un rendement de purification, et c'est la ou je ne sais pas trop comment faire, je penser faire un bradford et un kalckar et faire un rapport des 2 pour le rendements, je suis un peu perdu, ensuite pour la caracterisation des S-S je fais une réaction avec de l'insuline et du DTT.

[piwi]

Le [His]6 tag va vous permettre (1) de purifier et (2) de faire vos WB facilement en utilisant un anticorps dirigé contre lui plutôt que de courir contre un anticorps dirigé contre la protéine.
Pour le calcul du rendement, je ne vois pas ce que le kalckar va apporter. Le Bradford est suffisant.
Enfin, cela fait deux fois que vous écrivez que vous pensez utiliser de l'insuline pour caractériser vos ponts disulfures. Je ne vois pas bien en quoi cela va vous être utile. Du beta mercaptoéthanol ok, de l'urée ok, du DTT ok, mais de l'insuline, je ne vois pas.

piwi

[invitefee5b5b5]

Voila pourquoi j'utilise de l'insuline.

[piwi]

OK j'avais mal compris la question. C'est la protéine qui a des capacités de réduction des ponts s-s. Dans ces conditions, votre idée est bonne et la mettre en œuvre n'est pas trop difficile en plus. Vous avez votre insuline, vous la mettez en présence de votre enzyme d'un coté et en présence de DTT d'un autre, et enfin en présence de l'enzyme + DTT. Vous éliminez votre enzyme sur colonne NiTA, vous concentrez le tout et vous déposez dans un gel non dénaturant puis coloration au coomassie. Vous montrerez ainsi qu'en présence de l'enzyme + DTT l'insuline est décomposée en ses 2 sous-unités (pourrait être démontré en faisant un WB avec des Ig dirigés contre l'une et l'autre d'entre elles).

piwi