Purification des proteines Linases dans la levure

[invite7ec563a2]

Salut a tous!"
je suis en etudiante en biologie et je prepare actuellement ma licence. Le theme sur lequel je travaille est la purification des proteines kinases (proteine Kinase A) dans la levure .
J ai commence par purifier une kinase(tpk2) dans e. coli mais il c est avere que la dite kinase n est pas active dans cette bacterie...
Concernant la purification dans la levure je suis a la recherche de protokolle, website, skript...ou je pourrai trouver un procede detaille, car je suis jusque la en train d essayer differantes solutions (par ex. washbuffer et Runningsbuffer contenant de l histidin ou alors du KPO4, du NaCl...)mais jusque la je n ai pas obtenu de resultats.
Se serai bien si quelqu un pourrait m aider.....
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[piwi]

bonjour.

Faites quand même gaffe à votre orthographe. Un protokolle? Un skript?
Sinon, est ce que quelqu'un vous encadre? J'ai la nette impression que vous n'avez aucune idée de ce que vous êtes en train de faire.
Quels sont votre stratégie et vos outils? PKA clonnée en pET?

[invite7ec563a2]

Salut piwi
d´ abord desole pour l orthographe mais j etudie en Allemand ce qui fait que parfois j ecris directement les mots en allemand lorsque ceux ci sont similaires au francais ou a l anglais et c etait lecas pour "protokolle" et "Skript".
En fait vous n avez pas vraiment tort, je n ai pour le moment pas vraiment d idee concernant la procedure et celui qui est sence m encadrer m envoie vers des recherches sur le net......
En resume la proteine kinase Tpk2 doit etre clonee dans pET19b et ensuite exprimee et purifiee dans la levure(Cereviseae).J avais deja essaye d exprimer et de purifier cette kinase dans Bl21 mais la dite kinase n est pas active dans BL21...Et mon probleme est que je ne sait pas vraiment comment exprimer et purifier cette kinase dans la levure. tpk2 a deja ete clonee dans pEt 19b mais maintenant comment la purifiee??? Jai essaye plusieurs buffer (en batch test) comme par ex pour l´elutionbuffer(histidine,NaCl ou alors KPO4, NaCl) mais ca fonctionne pas...Et je me demande qu est ce que je pourrai bien ameliorer pour que ca fonctionne......

[piwi]

Vous m'avez l'air bien perdu.
Les pET sont des vecteurs d'expression prévus pour fonctionner en bactéries. Donc aller les mettre dans des levures n'est pas une bonne idée.
Ensuite je me demande si vous avez pensé à induire l'expression de votre vecteur par l'IPTG. Parce que si vous ne mettez pas d'IPTG, la protéine n'est simplement pas produite.
Une fois votre induction effectuée le mieux à faire est de prendre un aliquote de votre culture bactérienne et de le faire migrer dans un gel acryl pour voir si une bande est induite (controle, la culture bactérienne non induite ou non transformée). Vous colorez le gel avec ce que vous voulez (amidoblack, rouge ponceau, coomassie, bleu colloïdal, instant blue, je déconseille la coloration à l'argent en première approche) et vous cherchez votre bande.
Vous avez déjà fait tout cela en BL21 ? A vous lire j'ai comme un doute.

Cordialement,
piwi

[A voir en vidéo sur Futura]