Vecteur pET15b et 19b

[invite6f922aa5]

Bonjour à tous,
Je suis entrain de tenter de sur-exprimer des protéines chez les cellules BL21 DE3 et malheuresement ça ne surexprime pas... Le vecteur utilisé est le pET19b et en parcourant un peu la biblio je suis tombé sur un article où pour la surexpression de la même protéine le vecteur pET 15b a été utilisé. En comparant les deux vecteurs une seule différence est apparue: c'est au niveau du site de clivage de l'His-Tag, sur le pET19b c'est un site pour une entérokinase tandis que chez pET 15b c'est un site pour la trombine. Pensez vous que la présence du site de fixation de l'entérokinase (AspAspAspAspLys) pourrait "géner" la surexpression qui a déja été réussi lorsque le site de la thrombine ( LeuValProArgGlySer)le remplace?
En vous remerciant.
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[invitec0b62935]

Bonjour à tous,
Je suis entrain de tenter de sur-exprimer des protéines chez les cellules BL21 DE3 et malheuresement ça ne surexprime pas... Le vecteur utilisé est le pET19b et en parcourant un peu la biblio je suis tombé sur un article où pour la surexpression de la même protéine le vecteur pET 15b a été utilisé. En comparant les deux vecteurs une seule différence est apparue: c'est au niveau du site de clivage de l'His-Tag, sur le pET19b c'est un site pour une entérokinase tandis que chez pET 15b c'est un site pour la trombine. Pensez vous que la présence du site de fixation de l'entérokinase (AspAspAspAspLys) pourrait "géner" la surexpression qui a déja été réussi lorsque le site de la thrombine ( LeuValProArgGlySer)le remplace?
En vous remerciant.

C'est possible mais ce qui me semble plus probable, c'est que tu as de la protéolyse spontanée entre le tag et ta protéine d'intérêt dans un seul des deux cas. Ta protéine est présente dans le lysat cellulaire ou non ?

[invite9c3036c2]

Bonjour, je ne sais pas si plus de 10 ans après quelqu'un va me répondre, mais : quelle est la fonction du site thrombine du vecteur pET15b? Merci.

[Saswordz]

Bonjour,

Ca permet de cliver le His-Tag pour que votre protéine purifiée à la fin ne soit plus taguée.

[A voir en vidéo sur Futura]