PCR "long range" sur des produits de Revrse transcription, possible ?

[inviteac276b84]

Bonjour à tous,

Je suis en train d'essayer de mettre au point une PCR pour amplifier un fragment de 5kb à partir de produits de reverse transcription (superscript 1 invitrogen avec random primer) dans le but de cloner cet amplicon dans un plasmide.
J'ai a peu près tout changé : température d'hybridation, taq (maintenant je suis en Phusion, NEB), DMSO, tampon GC rich, et même le produit de RT (j'ai fini par tester la PCR sur des produits de RT vendus par roche) mais rien n'a fonctionné...
Je me pose donc la question suivante : est-ce que vous pensez qu'il est possible d'amplifier 5kb à partir de produits de RT?

Merci beaucoup de vos futures réponses

Vincent
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[Flyingbike]

a mon avis 'est surtout la RT qu'il faut changer. Si tu n'as pas de produit de 5kb tu ne pourras jamais le amplifier. Il faut peut être utiliser des amorces spécifiques et prendre une reverse transcriptase plus processive et plus efficace. Il y en a des spéciales pour les longs transcrits;.

[inviteac276b84]

Pardon... Ma réponse est très très tardive... mais merci beaucoup.
J'ai effectivement fait ce que tu m'a conseillé en prenant un RT spécifique long cDNA et c'est bon mon clonage est fait. J'ai utilisé en revanche des primer poly-dT.
Donc merci beaucoup de ta réponse et désolé de mon impolitesse...

Vincent