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digestion de plasmide



  1. #1
    mkh

    digestion de plasmide


    ------

    bonjour
    j'ai digéré mon plasmide pbluescript avec ECOR I le problème c'est que je me suis rendue compte après que le tampon OPA seul avec le plasmide sans Enzyme provoque une digestion de ce dernier donc le tampon contient des endonucléases sachant que je ne peux pas jeter le tampon parce que sinon je dois patienter 3 mois pour recevoir la prochaine commande une dilution de tampon serait elle efficace pour se débarrasser des nucléases? Même si je sais que ce n'est pas la bonne solution
    cordialement,
    mkh

    -----

  2. Publicité
  3. #2
    Seron

    Re : digestion de plasmide

    Dans tous les cas, non =/ En plus, n'oublie pas qu'un tampon, c'est un mélange précis de sels, ... si tu le dilues, tu modifies aussi ses paramètres là.

    Si dans le tampon que tu as utilisé y a des nucléases, tu peux balancer ta restriction que tu as faites (car ton ADN est coupé dans tous les sens) et la refaire avec un tampon plus adapté. Si je me trompe pas, un bête tampon H fera l'affaire pour une digestion EcoRI de pBluescript (le tampon est fourni avec l'enzyme).

    J'ai pas très bien compris si ta commande si c était pour du pBluescript ou pour du tampon mais si c'est pour le pBluescript, normalement tu as du sauver ton plasmide dans une souche E. coli, donc tu l'as ressort du congélo et tu refais une miniprep (si tu l'as pas sauvé ben t'attend et la prochaine fois, tu le sauves avant de le restreindre)

  4. #3
    piwi

    Re : digestion de plasmide

    bonjour.

    Tous les fournisseurs donnent la recette de leurs tampons. Ce sont de bêtes solutions salines très faciles à refaire. Je dirais que la solution de replis serait donc de le faire soit même sans attendre.

    Cordialement,
    piwi
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  5. #4
    mkh

    Re : digestion de plasmide

    je vous remercie infiniment pour votre collaboration je vais préparer les tampons moi même merci je tiens à vous informer Seron que le problème vient des tampons et non pas des plasmides merci pour votre coopération

  6. #5
    Seron

    Re : digestion de plasmide

    Le plus rapide, t'utilise un tampon H avec ton enz EcoRI (c'est fourni avec, faut pas préparer soit-même, tu perds ton temps !)

    3 minutes chrono !

    Protocole : 1µl tampon 10x, 0.5 Enzyme EcoRI et 8.5 plasmide

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    piwi

    Re : digestion de plasmide

    Ce n'est pas si simple que cela.
    H buffer est le buffer pour l'enzyme promega. Pour la même enzyme chez NEB ce sera n'importe quel tampon (NEB1 à 4). Chez fermentas, c'est le orange buffer. Chez Roche se sera le buffer A... Il va sans dire que tous ces buffers sont différents. La bonne pratique recommande d'utiliser le buffer correspondant à l'enzyme du fournisseur. Il n'est écrit nul part que mkh utilise l'enzyme de proméga. Plus, elle utilise le buffer one phor all (pharmacia/GE healthcare; je ne suis même pas certain que ce soit encore commercialisé). Et d'ailleurs, je pense que si mhk avait des stocks de buffer à disposition, elle l'utiliserait.

    Cordialement,
    piwi
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

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  10. #7
    Seron

    Re : digestion de plasmide

    Pas faux piwi ! Maintenant comme tu l'as dit, le buffer est spécifique de firme alors je sais pas si c'est une meilleure idée de le faire soi-même. En pratique, l'enzyme est normalement la même, donc le tampon devrait l'être aussi. Je crois qu'il est possible de trouver un tableau de comparaison entre les buffers des différentes firmes (sur biolabs je crois).

    Mais le bon sens voudrait que l'enzyme soit fournie avec le buffer correspondant ! (et tout le monde sait que y a toujours trop de buffer ^^)

    Voilà, j'espère que ça peut aider

    Seron

    Cordialement,
    Seron

  11. #8
    piwi

    Re : digestion de plasmide

    Il y a souvent de vieux stocks d'enzymes dans les labos dont le buffer a disparu (parce que perdu, parce que conservé par le stock général de l'institut). Ça ne m'étonne pas plus que cela. Pour les recettes, elles sont très simples et toujours disponibles sur les sites des fournisseurs. Ça ne pose aucune difficulté à préparer.

    Cordialement,
    piwi
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  12. #9
    Seron

    Re : digestion de plasmide

    C'est bon à savoir en tout cas

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