plasmide -digestion par enzymes de restriction

[invitec6340661]

Bonjour,

Je suis en 2ème année de pharma et je dois préparer un td à la maison sur les biotechnologies. Je n'en ai quasiment pas fait en 1ère année du coup je suis un peu perdue.

On me dit que je dois dessiner un plasmide après sa digestion par Xho I et Nco I (déterminer les extrémités du plasmide) et je suis incapable de le faire parce-que je comprends ce que je dois faire ni quels outils utiliser.

On m'a donné :
site de restriction NcoI
5'... CCATGG... 3' l'enzyme coupe entre les deux CC
3'... GGTACC...5' l'enzyme coupe entre les deux CC

site de restriction XhOI
5'... CTCGAG... 3' l'enzyme coupe entre C et T
3'... GAGCTC... 5' l'enzyme coupe entre T et C

Je sais pas du tout qu'est-ce que je dois faire avec ça?

Si vous pouviez me donner des pistes, ça serait vraiment sympa, merci!
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[invitec6340661]

Dans mes papiers, j'ai aussi écrit "multiple cloning sites " (NcoI-XhoI) : 158-217; je sais pas si ça doit aider? Je suis complètement perdue...

[invite02cefc91]

Tu as la carte initiale du plasmide ?

Il faut que tu regardes si tu as un sites ou plusieurs sites pour tes deux enzymes pour connaître le nombre de coupures potentielles dans le plasmide

[invitec6340661]

Bah je suppose qu'il n'y en a qu'un pour chacun non? Vu que dans mon annexe, je lis pour XhoI : 1#Sites et location 158 et pour NcoI : 1#Sites et location 212

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite02cefc91]

Si tu digères XhoI/NcoI, la région entre 158 et 217 ne sera plus dans le plasmide. Comme tu connais les sites de coupure, tu peux ainsi deviner les extrémités du plasmides que ce soit en 5' et en 3'.
Tu va passer d'une forme circulaire à une forme linéaire après digestion. On te demande donc de trouver les extrémités du plasmide.

[invitec6340661]

Je suis désolée mais je comprends pas ce que je dois faire... J'ai bien compris que si on coupe un plasmide circulaire via une enzyme de restriction il devient linéaire mais les extrémités c'est quoi?

[invite02cefc91]

Une fois linéaire, le plasmide possède des extrémités. D'un côté coupée par XhoI et l'autre coupé par NcoI.

On te demande juste la séquence de ces extrémités. Comme tu sais comment coupent les enzymes, tu connais l'extrémité.

Imaginons que tu as comme séquence en 5' :

5'-NNNNNNNCCATGGNNNNNCTCGAGNNNN-3'

(Le N représente n'importe quelle nucléotide).

Donc NcoI va reconnaitre CCATGG et va couper entre les deux C. Donc une fois linéaire tu auras NNNNNNC d'un côté et CATGGNNNNN de l'autre
et XhoI va reconnaitre CTCGAG et va couper entre C et T. Donc une fois linéaire tu auras NNNNNC et TCGAGNNNN.

Tu perds bien évidemment le fragment entre les deux sites. Donc au final, tu as deux extrémités qui seront ?

[invitec6340661]

NNNNNNNNC et TCGAGNNNNN ?

[invite02cefc91]

Alors un plasmide, tu peux le lire dans deux sens. Là, tu as les extrémités dans un sens, dans l'autre sens, ça donne ?

[invitec6340661]

5'NNNNNNNNC 3'
3'NNNNNNNNG 5'

et 5'TCGAGNNNNN 3'
3'AGCTCNNNNN 5'

En fait, je dois les coller les séquences ou les séparer? Je mets 5' NNNNNNCTCGAGNNNNN 3' ou il y a qqchose entre les deux?

Et d'ailleurs, quand j'écris mes extrémités, il faut que je mette NNNNNC ou je commence par C?

J'ai du mal à comprendre à quoi sert la digestion en fait...

[invite02cefc91]

Non, tu dois les séparer, car le plasmide est linéaire après digestion ...

Tu digères un plasmide lorsque tu veux modifier ce dernier, y rajouter un fragment ou en retirer un. On passe avant tout par cette étape de digestion. Après tu as un étape de ligation si éventuellement tu veux recirculariser le plasmide après y avoir insérer un fragment entre XhoI et NcoI.

En fait la séquence complète de ton plasmide linéarisé sera :

5'-CNNNNNNNNNCTCGA-3' si tu le lis depuis NcoI vers XhoI

et

5-TCGAGNNNNNNG-3' si tu le lis depuis XhoI vers NcoI

Je n'ai pas exactement respecté le nombre N, mais c'est juste que tu comprennes le principe. Dis moi si ce n'est pas clair !

[invitec6340661]

Ok, j'ai bien compris,merci. Par contre, le nombre de N ça correspond à 217 - 158 ? Il faut que je les écrive ?

[invite02cefc91]

Effectivement, le nombre de N équivaut à ce qu'il y a de part et d'autres des sites de restriction. Tu peux donc déterminer le nombre si tu connais la taille du plasmide. Mais possèdes-tu ces informations ?

[invitec6340661]

Je vous mets en pièce jointe l'annexe que j'ai... Je sais pas si ça peut correspondre? Est-ce que vous auriez d'autres exemples ou des livres où je puisse m'entraîner? Je me sens pas du tout au point avec ça.

[invite02cefc91]

d'accord, je regarderais dès que ce sera validé. Après, si tu as besoin d'exercices, je peux t'en proposer par mail si tu as besoin d'entrainement !

[invitec6340661]

Avec joie! (j'ai mon premier contrôle continu le 18 octobre; il faut absolument que je m'entraîne d'autant que je commence les TP la semaine prochaine donc je suppose qu'il faut déjà que je maîtrise la théorie et comme on a eu un seul TD sans cours...) Merci beaucoup!!!

[invite02cefc91]

Effectivement, (bon même si c'est à l'envers , tu peux déterminer la taille de ton plasmide (environ 300pb). Donc tu dois pouvoir calculer le nombre de nucléotides de chaque coté après coupure.