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plasmide -digestion par enzymes de restriction



  1. #1
    isou38

    plasmide -digestion par enzymes de restriction


    ------

    Bonjour,

    Je suis en 2ème année de pharma et je dois préparer un td à la maison sur les biotechnologies. Je n'en ai quasiment pas fait en 1ère année du coup je suis un peu perdue.

    On me dit que je dois dessiner un plasmide après sa digestion par Xho I et Nco I (déterminer les extrémités du plasmide) et je suis incapable de le faire parce-que je comprends ce que je dois faire ni quels outils utiliser.

    On m'a donné :
    site de restriction NcoI
    5'... CCATGG... 3' l'enzyme coupe entre les deux CC
    3'... GGTACC...5' l'enzyme coupe entre les deux CC

    site de restriction XhOI
    5'... CTCGAG... 3' l'enzyme coupe entre C et T
    3'... GAGCTC... 5' l'enzyme coupe entre T et C

    Je sais pas du tout qu'est-ce que je dois faire avec ça?

    Si vous pouviez me donner des pistes, ça serait vraiment sympa, merci!

    -----

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  3. #2
    isou38

    Re : plasmide -digestion par enzymes de restriction

    Dans mes papiers, j'ai aussi écrit "multiple cloning sites " (NcoI-XhoI) : 158-217; je sais pas si ça doit aider? Je suis complètement perdue...

  4. #3
    malesore

    Re : plasmide -digestion par enzymes de restriction

    Tu as la carte initiale du plasmide ?

    Il faut que tu regardes si tu as un sites ou plusieurs sites pour tes deux enzymes pour connaître le nombre de coupures potentielles dans le plasmide
    Seul l'étang calme reflète les étoiles

  5. #4
    isou38

    Re : plasmide -digestion par enzymes de restriction

    Bah je suppose qu'il n'y en a qu'un pour chacun non? Vu que dans mon annexe, je lis pour XhoI : 1#Sites et location 158 et pour NcoI : 1#Sites et location 212

  6. #5
    malesore

    Re : plasmide -digestion par enzymes de restriction

    Si tu digères XhoI/NcoI, la région entre 158 et 217 ne sera plus dans le plasmide. Comme tu connais les sites de coupure, tu peux ainsi deviner les extrémités du plasmides que ce soit en 5' et en 3'.
    Tu va passer d'une forme circulaire à une forme linéaire après digestion. On te demande donc de trouver les extrémités du plasmide.
    Seul l'étang calme reflète les étoiles

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    isou38

    Re : plasmide -digestion par enzymes de restriction

    Je suis désolée mais je comprends pas ce que je dois faire... J'ai bien compris que si on coupe un plasmide circulaire via une enzyme de restriction il devient linéaire mais les extrémités c'est quoi?

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  10. #7
    malesore

    Re : plasmide -digestion par enzymes de restriction

    Une fois linéaire, le plasmide possède des extrémités. D'un côté coupée par XhoI et l'autre coupé par NcoI.

    On te demande juste la séquence de ces extrémités. Comme tu sais comment coupent les enzymes, tu connais l'extrémité.

    Imaginons que tu as comme séquence en 5' :

    5'-NNNNNNNCCATGGNNNNNCTCGAGNNNN-3'

    (Le N représente n'importe quelle nucléotide).

    Donc NcoI va reconnaitre CCATGG et va couper entre les deux C. Donc une fois linéaire tu auras NNNNNNC d'un côté et CATGGNNNNN de l'autre
    et XhoI va reconnaitre CTCGAG et va couper entre C et T. Donc une fois linéaire tu auras NNNNNC et TCGAGNNNN.

    Tu perds bien évidemment le fragment entre les deux sites. Donc au final, tu as deux extrémités qui seront ?
    Seul l'étang calme reflète les étoiles

  11. #8
    isou38

    Re : plasmide -digestion par enzymes de restriction

    NNNNNNNNC et TCGAGNNNNN ?

  12. #9
    malesore

    Re : plasmide -digestion par enzymes de restriction

    Alors un plasmide, tu peux le lire dans deux sens. Là, tu as les extrémités dans un sens, dans l'autre sens, ça donne ?
    Seul l'étang calme reflète les étoiles

  13. #10
    isou38

    Re : plasmide -digestion par enzymes de restriction

    5'NNNNNNNNC 3'
    3'NNNNNNNNG 5'

    et 5'TCGAGNNNNN 3'
    3'AGCTCNNNNN 5'

    En fait, je dois les coller les séquences ou les séparer? Je mets 5' NNNNNNCTCGAGNNNNN 3' ou il y a qqchose entre les deux?

    Et d'ailleurs, quand j'écris mes extrémités, il faut que je mette NNNNNC ou je commence par C?

    J'ai du mal à comprendre à quoi sert la digestion en fait...
    Dernière modification par isou38 ; 01/10/2011 à 20h18.

  14. #11
    malesore

    Re : plasmide -digestion par enzymes de restriction

    Non, tu dois les séparer, car le plasmide est linéaire après digestion ...

    Tu digères un plasmide lorsque tu veux modifier ce dernier, y rajouter un fragment ou en retirer un. On passe avant tout par cette étape de digestion. Après tu as un étape de ligation si éventuellement tu veux recirculariser le plasmide après y avoir insérer un fragment entre XhoI et NcoI.

    En fait la séquence complète de ton plasmide linéarisé sera :

    5'-CNNNNNNNNNCTCGA-3' si tu le lis depuis NcoI vers XhoI

    et

    5-TCGAGNNNNNNG-3' si tu le lis depuis XhoI vers NcoI

    Je n'ai pas exactement respecté le nombre N, mais c'est juste que tu comprennes le principe. Dis moi si ce n'est pas clair !
    Seul l'étang calme reflète les étoiles

  15. #12
    isou38

    Re : plasmide -digestion par enzymes de restriction

    Ok, j'ai bien compris,merci. Par contre, le nombre de N ça correspond à 217 - 158 ? Il faut que je les écrive ?

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  17. #13
    malesore

    Re : plasmide -digestion par enzymes de restriction

    Effectivement, le nombre de N équivaut à ce qu'il y a de part et d'autres des sites de restriction. Tu peux donc déterminer le nombre si tu connais la taille du plasmide. Mais possèdes-tu ces informations ?
    Seul l'étang calme reflète les étoiles

  18. #14
    isou38

    Re : plasmide -digestion par enzymes de restriction

    Je vous mets en pièce jointe l'annexe que j'ai... Je sais pas si ça peut correspondre? Est-ce que vous auriez d'autres exemples ou des livres où je puisse m'entraîner? Je me sens pas du tout au point avec ça.
    Images attachées Images attachées

  19. #15
    malesore

    Re : plasmide -digestion par enzymes de restriction

    d'accord, je regarderais dès que ce sera validé. Après, si tu as besoin d'exercices, je peux t'en proposer par mail si tu as besoin d'entrainement !
    Seul l'étang calme reflète les étoiles

  20. #16
    isou38

    Re : plasmide -digestion par enzymes de restriction

    Avec joie! (j'ai mon premier contrôle continu le 18 octobre; il faut absolument que je m'entraîne d'autant que je commence les TP la semaine prochaine donc je suppose qu'il faut déjà que je maîtrise la théorie et comme on a eu un seul TD sans cours...) Merci beaucoup!!!

  21. #17
    malesore

    Re : plasmide -digestion par enzymes de restriction

    Effectivement, (bon même si c'est à l'envers , tu peux déterminer la taille de ton plasmide (environ 300pb). Donc tu dois pouvoir calculer le nombre de nucléotides de chaque coté après coupure.
    Seul l'étang calme reflète les étoiles

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