Clonage, plasmide et enzymes de restriction

[Hellbly]

Bonjour,

Je suis un peu submergé par quelques notions d'un exercice de Biologie moléculaire, votre aide me serait très précieuse.

Un clonage d'un gène d'intérêt sur un vecteur type plasmide est effectué à l'aide d'EcoRI.
On observe alors trois types de plasmides recombinants (en effet il y a trois sites(A,B et C) pour EcoRI sur le fragment d'ADN et un seul sur le plasmide => Vecteur-AB, Vecteur-BC et Vecteur-AC).

On digère ensuite ces plasmides recombinants à l'aide d'EcoRI, BamHI, SalI et BamHI/SalI. Séparément bien entendu.

Sachant :
- trois sites de coupure sur le plasmide.
- 7 sites sur le fragment d'ADN sur lequel est le gène d'intérêt.

Je dois dessiner les profils attendus pour chaque plasmide après électrophorèse sur agarose et coloration au BEt.

Ma question est donc la suivante :

La portion d'ADN clonée sur le vecteur n'a pas de sens vu que les sequences des extrémités sont identiques...
Donc pour le fragment AB, il peut y avoir Vecteur-AB et Vecteur-BA ?
Ceci ne change rien pour l'expression du gène, mais du coup après l'action des enzymes de restriction, cela va induire deux fois plus de fragments à tailles différentes que s'il n'y avait eu que le Vecteur-AB ?
En effet les sites des enzymes n'étant pas situés au centre des fragments incorporés, l'asymétrie modifie alors les distances selon le sens d'incorporation ?

Ces notions me paraissent à la fois claires et obscures u___u
En gros vais-je devoir tracer deux fois plus de bandes (plus ou moins, car certains fragments feront la même taille et se superposeront sur le gel) que ce que je pensais initialement ?

J'espère avoir été le plus clair possible.
Cordialement,
Raph
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[invitebd27bf8a]

Bonjour à tous,

Ma réflexion se porte sur le choix de l'enzyme de restriction (ER) (en rapport avec exercice en pièce jointe).
Selon moi, le choix de l'ER se porte:
- sur la fréquence de coupure
- sur obtention d'un site de restriction compatible avec le plasmide
- le faite que le site soit présent en un seul exemplaire sur le plasmide
- et que ce site se situe uniquement sur l'une des régions de résistance (Amp^R ou Tet^R)

D'office, j'éliminerai l'ER:
- AfeI (car présent en 2 exemplaires)
- EcoRI (car situé en dehors des régions de résistance)
- CaiI, SbfI et SwaI (car probabilité de coupure trop faible: 1 site tous les 262kpb pour CaiI et 1 site tous les 65,5kpb pour SbfI et SwaI)

Je sais que l'on peut utiliser plusieurs ER tant que leur site est compatible. Mais maintenant, comment dois-je procéder pour le(s) choisir sachant que je ne connais pas la taille de l'ADN génomique ?

Merci d'avance l'aide!

[piwi]

Personnellement j'aurais tendance à utiliser EcoRI et BamHI.
Il y a deux intérêts. En réalisant une digestion ménagée on arrivera à avoir des fragments chevauchant (intérêt pour la reconstruction du génome), et de plus, l'insertion du fragment dans la cassette Tet^R va permettre de sélectionner les clones recombinant en repiquant les colonies.

Cordialement,
piwi

[invitebd27bf8a]

Donc selon vous, il faudrait faire une double digestion ménagé sur l'ADN génomique ? Mais si on digère le plasmide avec BamHI, les extrémités des fragments d'ADN obtenus grâce à EcoRI ne pourront pas s'intégrer au plasmide, puisse que BamHI et EcoRI diffèrent par leur site ?

[A voir en vidéo sur Futura]