Bonjour,
Pour un TP de biologie moléculaire je dois couper un plasmide avec deux enzymes de restriction différentes, je voulais savoir comment (si c'est possible) empêcher le fragment découpé de se recoller à mon plasmide et ensuite comment récupérer mon vecteur ouvert (mes cours ne sont pas clairs du tout).
Est-ce que ce serait possible par exemple d'éliminer les extrémités 3' OH et 5' P pour justement éviter recollement du fragment sur mon plasmide?
Merci beaucoup !
Si vous coupez avec les deux enzymes en même temps, il n'est pas nécessaire de déphosphoryler le vecteur parce que même si cela peut se produire cest mineur, dans ces proportions insert:vecteur
Ce qu'on fait pour empêcher un vecteur de se recirculariser c'est en effet une dephosphorylation qu'on réalise.
D'accord, merci de votre réponse !
Et aussi, comment je peux faire pour récupérer mon plasmide après la digestion? Je ne comprends pas si je dois passer par une électrophorèse ou une colonne de silice ou aucun des deux..
Vous pouvez le purifier sur gel
Sur colonne ca dépendra de la taille de l'insert , s'il est petit on peut s'en débarrasser, s'il est grand on le récupérera en même temps que l'insert...
