Bonjour,
j'ai un tp de bio mol et on me demande de proposer une approche expérimentale pour vérifier la spécificité de l'amplification PCR, ainsi qu'1 approche pour vérifier l'efficacité de la digestion par des enzymes de restriction.
Est ce que quelqu'un pourrait m'aider parce que je n'ai aucune idée de comment faire.
Merci
Commencons par la première question:Envoyé par lala62
- Proposer une approche expérimentale afin de vérifier la spécificité de l'amplification PCR; en clair, quelle expérience ferais-tu pour t'assurer que lorsque tu fais ta PCR, tes amorces (tes oligos) se fixent sur la séquence que tu cibles ? Que ne comprends-tu pas dans cet énoncé ?
peut étre en utilisant des amorces marquées?
Ca ne dira rien de la spécificité. Juste que ce sont vos amorces qui permettent l'amplification. Mais ça vous vous en doutez.
Donc non, ce n'est pas la solution.
Vous savez ce qu'est une courbe de fusion? Vous connaissez le TA cloning? Chacune de ces choses permet de tester la spécificité d'amplification d'une certaine manière.
Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.
non je n'ai pas vu cela.Qu'est ce qu'une courbe de fusion?
Pour vérifier l'efficacité de la digestion par les enzymes de restriction, je fais une électrophorèse?
Merci
La première chose à faire est de faire migrer un aliquote de votre PCR dans un gel d'agarose. Combien de fragments? Quelle taille on-t-ils? Est ce compatible avec ce que vous attendiez?
Pour aller un peu plus loin, vous savez que la dénaturation de l'ADN dépend de sa composition en base. C'est ainsi que l'on détermine pour une séquence donnée une température de melting (fusion) pour laquelle la moitié de votre fragment d'ADN est dénaturé. Comme chaque fragment a une composition en base qui lui est propre, chaque fragment a une Tm. Certains appareils parviennent à le mesurer.
La Taq polymérase ajoute un A aux extrémités des fragments qu'elle génère. Il existe des plasmides qui exploitent cela pour permettre l'insertion facile de tout fragment de PCR (TA cloning). Vous clonez et vous séquencez. Là vous savez à la base près ce que vous avez amplifié.
Cordialement,
piwi
Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.
