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TP digestion ADN par enzymes de restriction par électrophorèse sur gel d'agarose

  1. #1
    Azaaar

    Exclamation TP digestion ADN par enzymes de restriction par électrophorèse sur gel d'agarose

    Bonjour/Bonsoir,

    J'ai fais une extraction d'ADN puis je l'ai mis en présence d'enzyme de restriction ( c'est le TP basique avec les enzymes BamHI, EcoRI, HindIII) c'est de l'ADN de phage lambda cependant comment savoir si l'ADN a été digéré par élélectrophorèse sur gel d'agarose car j'observe plusieurs fragments mais je comprends pas trop si quelqu'un peut m'éclairer merci infiniment.

    -----


  2. Publicité
  3. #2
    Azaaar

    Re : TP digestion ADN par enzymes de restriction par électrophorèse sur gel d'agarose

    je comprends pas concrètement ce qu'est le marqueur de poids moléculaire j'ai cherché sur internet mais les définitions ne sont pas claires

  4. #3
    dalmia

    Re : TP digestion ADN par enzymes de restriction par électrophorèse sur gel d'agarose

    Bonjour,

    Maîtrises-tu bien ce qu'est une enzyme de restriction, et à quoi ça sert de faire une électrophorèse, pour commencer ?

    Pour t'amener sur la bonne réflexion : sais-tu si l'ADN de ce virus est linéaire ou circulaire ? As-tu la carte du génome qui te montrerait les sites de restriction dudit génome ?
    Une fois ces réponses trouvées : combien de fragment/s obtiens-tu s'il y a une seule coupure ? Deux coupures ? Quel est l'impact du nombre de coupures sur le résultat d'électrophorèse ?

    Si tu réfléchis bien à toutes ces questions, tu devrais pouvoir trouver

    Dalmia

  5. #4
    dalmia

    Re : TP digestion ADN par enzymes de restriction par électrophorèse sur gel d'agarose

    Le marqueur de poids moléculaire (appelé souvent ladder) porte bien son nom : c'est un mélange de fragments d'ADN de taille connue.
    Exemple : ton ladder contient des fragments de 5 tailles différentes (1000, 700, 500, 250 et 100 pb). Tu le fais migrer dans un gel, en parallèle de tes échantillons de manip.
    La migration et la révélation faites, tu peux légender ton gel grâce à ce ladder car la piste ne contient que 5 bandes, qui correspondent chacune à une taille, avec la plus légère qui a migré le plus loin (100 pb) et la plus lourde le moins loin (1000 pb). Par comparaison, tu peux en déduire la taille des fragments dans les échantillons de manip !

    Illustration : les tailles affichées à gauche de ce dessin n'ont pu être annotées que parce qu'il y a un marqueur (la première piste à gauche)
    Gel_Electrophoresis.svg.png

  6. #5
    Azaaar

    Re : TP digestion ADN par enzymes de restriction par électrophorèse sur gel d'agarose

    Bonjour, merci. Oui bien entendu je sais ce qu'est une enzyme de restriction. Une enzyme de restriction reconnait un site de restriction généralement palindromique sur l'ADN une fois reconnu elle clive. Alors j'utilise un ADN de phage lambda c'est de l'ADN circulaire il me semble mais qu'elle est le rapport avec la migration ? et oui je sais aussi c'est quoi l'électrophorèse sur gel d'agarose c'est la migration de fragments d'ADN ( dans mon cas) du fait qu'on exerce un champs électrique l'ADN étant chargé négativement va migré du coté positive au niveau de la matrice d'agarose les fragments les plus courts migreront plus vite et plus rapidement mais sa m'aide pas pour l'analyse car on a des bandes linéaire et non pas circulaire

  7. #6
    Azaaar

    Re : TP digestion ADN par enzymes de restriction par électrophorèse sur gel d'agarose

    De plus comment savoir si mon fragments d'ADN a été digéré ? J'aurais plusieurs fragments ? Où est ce en fonction de la migration ?

  8. #7
    Azaaar

    Re : TP digestion ADN par enzymes de restriction par électrophorèse sur gel d'agarose

    Car le soucis étant que sur certaine images ils disent que le fragments n'a pas été digérer alors que je vois une double bande comme par exemple :http://www.ens-lyon.fr/RELIE/PCR/res...pob/apob07.htm

    mon but c vraiment de comprendre pour pouvoir faire l'analyse seul je serais très reconnaissant a celui qui m'aidera

  9. #8
    Matdu17

    Re : TP digestion ADN par enzymes de restriction par électrophorèse sur gel d'agarose

    L'importance du fait que ton ADN au départ soit circulaire ou pas est que si tu coupes 1 fois par une enzyme une molécule d'ADN circulaire, tu vas te retrouver avec une seule bande sur ton électrophorèse, car tu auras juste linéarisé. Alors qu'une coupure sur un ADN déjà linéaire donnera deux fragments.

    Tu as l'air de savoir ce qu'est une enzyme de restriction et aussi de savoir interpréter une électrophorèse, je ne vois pas bien ce qui te bloque pour réussir ton exercice.

    Tu digères ton ADN de phage, tu te retrouves donc avec plusieurs morceaux d'ADN de différentes tailles que tu sépares sur un gel d'agarose pour voir leurs tailles (en comparant avec le marqueur de poids moléculaire qui sert d'étalon) et savoir combien de sites de restriction il y a dans ton ADN de phage. Et ensuite en comparant les profils de restrictions de chaque enzyme et des combinaisons de plusieurs enzyme tu peux déduire comment les sites de restrictions se trouvent les uns par rapport aux autres sur ton ADN de phage du départ.

  10. #9
    Azaaar

    Re : TP digestion ADN par enzymes de restriction par électrophorèse sur gel d'agarose

    D'accord donc si j'ai bien compris si je n'obtiens pas de fragments, c'est à dire que je reste avec la molécule d'ADN de départ ça veux dire qu'il n'y a pas eu digestion, alors que si je trouve plusieurs fragments qui sont à des positions différentes car migré de manière différente ça veux dire que mon fragment d'ADN initial a été digérer c'est ça ?

  11. #10
    dalmia

    Re : TP digestion ADN par enzymes de restriction par électrophorèse sur gel d'agarose

    Azaar, je prends de mon temps pour te répondre et te poser les questions qui t'aideront à comprendre "seul" comme tu le souhaites. As-tu pris un papier, un stylo, et réellement tenté de répondre aux questions que je te propose ? C'est ce que j'espérais dans ta réponse, mais tu tournes en rond dans tes questions. Tu dis vouloir comprendre seul mais on dirait plutôt que tu attends que tout tombe tout cuit sans jouer le jeu de la réflexion.

    Citation Envoyé par Matdu17 Voir le message
    L'importance du fait que ton ADN au départ soit circulaire ou pas est que si tu coupes 1 fois par une enzyme une molécule d'ADN circulaire, tu vas te retrouver avec une seule bande sur ton électrophorèse, car tu auras juste linéarisé. Alors qu'une coupure sur un ADN déjà linéaire donnera deux fragments.
    Un petit effort serait le bienvenu, je pense que c'est à la portée de tout le monde de trouver qu'une molécule circulaire coupée une fois donne 1 fragment linéaire, alors qu'une molécule linéaire coupée une fois donne 2 fragments. Non ? Et puisque tu as compris la technique, je ne vois pas non plus où tu peux être bloqué.

    Je suis allée regarder ta pièce jointe : Piste 2, ND, la plus grande bande est à 600 (attention c'est mal légendé, on est pas en kb mais en pb...). On s'en fiche des autres bandes plus claires : ce sont peut-être des contaminants, où les résultats d'un clivage spontané.
    Piste 3 : on voit deux bandes. ça correspond à combien de fragments du coup ? Donc à combien de coupures ? Donc à combien de sites de restriction EcoRI ?

    Dalmia

  12. #11
    Azaaar

    Re : TP digestion ADN par enzymes de restriction par électrophorèse sur gel d'agarose

    Merci Dalmia mais tu aurais un mail pour que je puisse te montré mon travail et voir ce qui va pas stp ?

  13. #12
    dalmia

    Re : TP digestion ADN par enzymes de restriction par électrophorèse sur gel d'agarose

    Pas de problème, seulement il faut que tu supprimes des (tous ?) messages car ta boîte de messagerie est pleine, il m'est impossible de t'écrire pour ton filer mon mail.

    Bonne soirée
    Dalmia

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