électrophorèse sur gel d'agarose

[invitec6340661]

Bonjour!

J'ai eu un TP de biotechnologie où on a fait une électrophorèse sur gel d'un plasmide purifié non digéré et d'un plasmide purifié dirigé par deux enzymes de restriction.

J'ai eu les résultats de la digestion et j'observe dans chaque cas 2 bandes: pour le plasmide non digéré j'ai une bande claire puis une bande foncée; et pour le plasmide digéré, j'ai d'abord la bande foncée puis la bande claire.

J'ai lu que l'ADN était présent sous forme linéaire, circulaire et superenroulé; que celui qui migre le plus lentement est le circulaire, le plus vite le linéaire et le superenroulé est intermédiaire. Dans mon cas, comme j'ai que 2 bandes ça veut dire que j'ai uniquement un mélange d'ADN linéaire et circulaire?

En fait, je voudrais déjà surtout savoir la différence entre les bandes claires et sombres: les bandes sont en rapport avec la proportion de la forme ?
Merci de votre aide
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[invitec6340661]

je suis en train de me dire que ça me parait logique que l'intensité de la bande reflète l'abondance... donc dans le cas de mon plasmide digéré, ça voudrait dire que j'ai plus de forme circulaire?
par contre, un plasmide non digéré: je devrais avoir une seule bande non?

[Yoyo]

Salut

Sauf si tu as plusieurs sites de restriction.

Yoyo

[v_711]

La digestion par des enzymes de restriction ne produit que de l'ADN linéaire.
Ta première enzyme ouvre le plasmide en coupant à un premier endroit. La seconde coupe à un autre site, et produit 2 morceaux de tailles différentes : d'où les 2 bandes.

Pour ce qui est de l'intensité dont tu parles, ne faudrait-il pas plutôt voir un rapport entre la taille des fragments ?
Plus gros fragment = plus d'ADN = intensité plus grande
(je demande confirmation)

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitef5962f47]

Pour ce qui est de l'intensité dont tu parles, ne faudrait-il pas plutôt voir un rapport entre la taille des fragments ?
Plus gros fragment = plus d'ADN = intensité plus grande
(je demande confirmation)

Pour le BET c'est bien le cas, je suppose que c'est pareil pour les autres intercalants de l'ADN. Par contre cette relation marche t'elle que pour les fragments linéaires ? Une bande correspondant a un plasmide surenroulé ne devrait-elle pas être moins intense du au fait que certaines bases de l'ADN soit inaccessible du a la topologie de l'ADN ou alors est-ce négligeable ?

[v_711]

J'ai déjà travaillé avec de l'iodure de propidium, et il me semble que l'effet est négligeable.
La notice du fabricant mentionne une fixation d'un fluorophore toutes les 5 bases sans préciser plus.
J'imagine que les très gros intercalants peuvent effectivement avoir du mal à aller se fixer sur un ADN enroulé...