Tampon de charge pour électrophorèse sur gel d'agarose

[invitebc476ca5]

Bonsoir à tous !

Tout d'abord, merci d'avoir pris la peine de cliquer sur ce post

Voilà, je suis en pleine rédaction de mon travail de fin d'étude qui portait sur l'utilisation de la RAPD-PCR en tant que méthode de différenciation d'espèces fongiques. Il a donc évidemment fallu passer par la réalisation d'une électrophorèse sur gel d'agarose.

Le souci que je rencontre est que personne dans le labo ne sait quelle est la composition exacte du tampon de charge des échantillons pour le gel. (j'ai utilisé un aliquot laissé par la dernière personne ayant fait de la génétique au labo mais qui a depuis quitté les lieux)

Auriez-vous une idée et de la composition ainsi que des quantités des réactifs pour en faire mettons 10 mL?

En farfouillant un peu sur le forum, je suis tombé sur ce post très intéressant :
http://forums.futura-sciences.com/bi...oanalyser.html
ou Flyingbike cite : "tris, bleu(s), glycerol ou sucrose, eventuellement EDTA"
Pour le Tris, duquel s'agit-il et à quel pH ?
De quel bleu s'agirait-il ?
Et à quoi servent ces différents composants pratiquement ?
Le Tris, je présume qu'il a pour rôle de stabiliser l'ADN, le colorant... de colorer le front de migration ^^, mais le glycérol et l'EDTA ?

Voilà, votre aide me serait vraiment très précieuse.

Merci d'avance !
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[gorben]

Salut,

Tu vas avoir autant de recette que de chercheur

Ce qui est important c'est le dye (bleu de bromophenol generalement) pour suivre la migration et le sucrose/ficoll/glycerol qui permettent a tes echantillons d'aller au fond du puit lorsque que tu deposes.

Le reste ca n'a pas/peu d'importance et peu etre omit. Si tu veux plus d'infos, essaie "agarose loading buffer" sur google.

A+

[invite71f23525]

Pour le tris, il a pour rôle de tamponner le tampon de charge, et il n'y a qu'un seul tris. On ajoute souvent HCl pour dire qu'on a descendu le pH avec de l'HCl car le tris est basique, donc tris-HCl. Tris-NaOH c'est lorsqu'on a augmenté le pH avec du NaOH pour faire une solution encore plus basique. Pour un tampon de charge, c'est Tris-HCl.

Le glycérol, Gorben a expliqué à quoi il servait, pour ce qui est de l'EDTA il a un rôle de stabilisation de l'ADN en empêchant sa dégradation par des DNase qui sont dépendantes de cofacteurs cationiques divalents (l'EDTA est un chélateur de cations divalents (Mg2+), ce qui veut dire qu'il les capture). Peut-être l'EDTA a-t-il un autre rôle que je ne connais pas...

[invitebc476ca5]

Merci beaucoup pour ces précieuses informations !!!
M'est d'avis que la recette devait approcher quelque chose comme :
* 25mg bromophenol blue
* 4g sucrose
* H2O to 10mL
Cependant, cela devait être du glycérol et non pas du sucrose dans mon cas, donc environ 4 mL j'aurais envie de dire ^^

J'en profite accessoirement de vous demander si vous ne connaissez pas un site pour retrouver la séquence d'une amorce à partir du nom utilisé dans un article ? Mon maître de stage est injoignable pour le moment et a embarqué tout le matériel car il a changé d'emploi ^^
Je suppose que les noms ne reflètent pas véritablement une séquence, mais je me trompe peut-être !

Encore merci de partager votre sagesse

[A voir en vidéo sur Futura]

[Flyingbike]

de quels noms parles-tu ?

pour le glycérol, 4mL dans 10 ca fait beaucoup. Fais du 25%, en l'utilisant a 4X ca fera 6,25% final.

[invitebc476ca5]

Bien reçu merci

Un nom du genre "P71" et "NS3" en l'occurrence.

[Flyingbike]

c'est le nom des gènes qu'elles amplifient peut être, non ?

[Flyingbike]

Dans ce cas, le nom d'un gène ne te donnera pas les amorces qui ont été utilisées. Il faut soit regarder si elles sont dans la publication (des fois en supplemental data) soit les demander aux auteurs, soit les designer toi-même.

[invitebc476ca5]

c'est le nom des gènes qu'elles amplifient peut être, non ?

J'en doute étant donné qu'il s'agit de RAPD PCR ca amplifie au petit bonheur la chance.

Merci beaucoup pour l'aide précieuse, en tout cas ! Bonne journée à vous !