Probleme purification sur gel d'agarose

[invite5ee91982]

Bonjour,

Je suis nouveau sur ce forum et fais appel a vous car je commence a desesperer...

Voila cela fait plusieurs fois que j'essaie de purifier une bande sur gel d'agarose sans succes.
Pour plus de precisions, je digere mon plasmide (50 microgrames) qui fais environ 10kb, afin d'exciser une bande a 300pb. Lorsque je fais migrer sur le gel, je vois parfaitement cette bande (qui doit logiquement contenir 1.2microgrammes d'ADN).

J'utilise le kit QIAquick gel extraction de chez Qiagen et suis le protocole a la lettre. Probeme: je n'ai pas d'ADN dans mon eluat...

Quelqu'un aurait il une idee car la je n'en peux plus!
Merci d'avance!

Pavel
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[Zellus]

Salut Pavel ! Bienvenue sur Futura !

qui doit logiquement contenir 1.2microgrammes d'ADN

1,5 mg plutôt non ?

Quelqu'un aurait il une idee car la je n'en peux plus!

C'est assez difficile à dire comme ça ...
Tu es sûr qu'il y a de l'éthanol dans ton tampon PE ?
Tu utilises un gel d'agarose de plus de 2% d'agarose ?
Tu utilises de l'isopropanol ?
Le mieux serait peut-être que tu nous dises exactement tout ce que tu fais (volume utilisés ...). Ca pourrait peut-être davantage aider à cerner le problème ...

[invite5ee91982]

Merci pour ta reponse.

Tout d'abord la quantite d'ADN dans ma bande est autour de 1 micrograme ce qui elimine toute possibilite de surcharge de la colone (dont la limite est 10 microg)

Apres avoir decoupe ma bande je la pese : 220g (le gel etait a 0.9%)
Je reprend dans 3vol de tampon QG (soit 660microL) pendant 10min a 50 degres (en vortexant toutes les 2min)

Apres cette etape mon gel est bien dissoud, je charge la colone avec cette solution (qui est au bon pH car il y a un indicatif de couleur) contenant mon adn je centrifuge 1min 16g a temperature ambiante.

Je jette le surnageant et recharge la colone avec 500microL de QG. Re-centri

750microL de tampon de lavage PE (avec l'ethanol, je confirme rien qu'a l'odeur!)
Re-centri

Elution dans 30microL de tampon (dont je n'ai pas verifier le pH d'ailleurs) puis desespoir! Rien dans mon tube!

Est ce qu'avec ces details quelqu'un aurait une idee??

Pavel

[invite5ee91982]

Oups pour le poids du gel je parle evidemment en mg pas en g!!

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite5ee91982]

Re-oups

Apres avoir dissoud mon gel dans le QG, je rajoute un vol de Gel en isopropanol (soit 220mL), promis cette fois j'ai tout dis!

[Zellus]

Oups pour le poids du gel je parle evidemment en mg pas en g!!

Oué moi aussi je me suis planté. Je voulais dire 1,5 μg.

Sinon tu recentrifuges 1 min après t'être débarassé du PE ? Je ne sais pas si c'est très gênant mais on sait jamais ...
Tu attends au moins 1 min avant d'éluer quand tu rajoutes ton tampon ?
C'est quoi d'ailleurs le tampon que tu utilises ?

[invite5ee91982]

Oui j'ai recentrifuger apres le PE et j'ai attendu 1min avant de centrifuger pour l'elution. Le tampon d'elution est celui du kit, j'imagine que c'est du TE a pH8,5.
Est il possible que des centrifugations a des vitesses trop fortes puissent affecter la liaison de l'ADN a la colone??? Je suis pas tres convaincu mais au point ou j'en suis!

[Zellus]

Pourquoi tu centrifuges à quelle vitesse ?

[invite5ee91982]

a 13200rpm ce qui fait plus de 16000g sur ma centri de paillasse. Mais c'est ce qu'ils recommandent dans le kit...

[Zellus]

Ok moi je fais pareil et ça marche très bien donc ton problème doit venir d'ailleurs ...

[invitec9f0f895]

Salut

tu as l'air de tout faire correctement... mon conseil serait d'ouvrir un kit nuef et de preparer toi meme le PE. et de prendre de nouvelles colones, il m'est arrivé des trucs bizarres avec certaines. Quand tu rajoutes ton tampon d'élution, il s'absorbe correctement sur la membrane?

Moi j'élue deux fois de suite pour récupérer le plus possible d'ADN, et perso je trouve que les kits de chez in vitrogene marchent 10x mieux.

Bon courage
YOYo

[invite491316cf]

Bonjourno,
je voulais juste savoir si le problème avait été résolu car, ayant eu le même, je peux peut être donner des conseils sur ce que j'ai testé?
a+

[invite71f23525]

Bonjour et bienvenue sur Futura Sciences,

Partages tout de même ton expérience, ça ne fais pas de mal et ça peut servir à quelqu'un passant par là.

Greg

[invite491316cf]

Bien alors pour ma part, je dois dire que j'ai pas mal fait de test mais, aucun n'a été LA révélation. J'ai juste un peu amélioré le rendement c'est tout.

Ce qui a été le plus efficace c'est de rajouter du NaoAc en grande quantité. En effet, le pH du TBE était trop élevé du coup la perte était maximale. Le mieux que j'ai obtenu a été de mettre 15µl de NaoAc pour 100mg de gel coupé.

Par contre, la vitesse de centrifugation ne change rien du tout sur le rendement, et la deuxième étape de 1minute après PE ne sert que pour éviter d'avoir des traces d'éthanol dans l'éluat.

Voilà c'est tout mais je reste toujours curieux de savoir s'il y a une solution miracle.