electrophorèse en gel d'agarose

[invite468ec3f9]

bonjour à tous
j'ai une question par rapport à un exercice que j'ai à faire.
"on a digéré un plasmide pBR322 par différentes enzymes et chacune de ces digestions a été soumise à une electrophorèse en gel d'agarose pendant 45 min.
expliquer les profils obtenus."
pour les canals 2 3 et 4 j'ai compris que puisqu'il n'y a qu'un site de restriction, le plasmide est ouvert à un endroit et le fragment est toujours de même taille. Mais je ne comprends pas ce qu'il en est du canal 1, le plasmide est pas digéré et on a plein de fragments de tailles différentes....
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[invitec9f0f895]

SAlut

L'ADN non digéré est super-enroulé, il donne donc des profils de migrations comme celui-ci. Avec des bandes correspondantes aux formes relachées, superenroulées etc;..

YOyo

[invite468ec3f9]

merci pour votre réponse.
est ce que mes interprétations pour les pistes 2 3 et 4 est correcte?
Je ne comprends pas alors le systeme de l'electrophorèse. les fragments les plus petits migrent le plus loin sur le gel. Mais un adn non fragmenté pourquoi migrerait il comment s'il était composé de plusieurs morceaux de tailles différentes. même si l'adn est surenroulé c'est toujours une entité avec une taille précise!!!!!
merci de m'éclairer

[invite17a570c1]

merci pour votre réponse.
est ce que mes interprétations pour les pistes 2 3 et 4 est correcte?

Perso, je ne visualise pas ta photo, donc...
pourrais-tu préciser ce qui te pose problème quand même?

Mais un adn non fragmenté pourquoi migrerait il comment s'il était composé de plusieurs morceaux de tailles différentes. même si l'adn est surenroulé c'est toujours une entité avec une taille précise!!!!!
merci de m'éclairer

Je ne comprends pas ta phrase (celle que j'ai soulignée).
En ce qui concerne ta deuxième question, lorsqu'on parle de surenroulé, on parle d'une question de taille ou de topologie?

Cordialement,

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite468ec3f9]

canal 1 pBR non digéré
canal 2 digéré par EcoRi
canal 3 digéré par BamHI
canal 4 digéré par PsTI

dans le canal 1 on obtient plein des bandes de différentes tailles qui migrent depuis le départ jusqu'à la limite du papier.
pour le canal 2 3 et 4 on obtient une bande pour chaque canal qui migre au même endroit.
pourquoi le canl 1 alors que l'adn n'est pas digéré ona plusieurs bandes ,
(pourquoi l'image n'est pas visible) ?
Merci d'avance

[invitee863e61a]

Les migrations en gel d'agarose ne séparent pas exactement les molécules d'ADN que sur le critère de leur taille, c'est de là que vient votre confusion: une même molécule ne va pas occuper le même volume selon qu'elle est linéaire ("un long fil"), qu'elle est circulaire ( "un grand rond", qui prend un plus grand volume et donc est retenu plus tôt dans le gel et donc migre moins loin).

Les plasmides extraits coexistent toujours sous plusieurs formes dans la cellule: l'une linéaire (et oui!) qui migre au plus loin dans le gel, une forme circulaire "classique" déroulée qui migre le moin loin et, entre les deux, des formes intérmédiaires représentant différents stades de surenroulemement (prenez un fil, raccordez les 2 bouts en rond puis enrouler le) qui occupent un volume plus petit que la forme ciculaire relachée.
Ceci explique les différentes formes du plasmide non digéré sur le premier puit.

[invite17a570c1]

Mais, Jmbowie, pourquoi tu donnes les réponses?
Méchant, va

[invitee863e61a]

Mais, Jmbowie, pourquoi tu donnes les réponses?
Méchant, va

J'avais pas vu que c'était un exercice! J'espère que ca incitera l'intéressé(e) à bien relire son cours, sans faire le raccourci " migre moins loin = molécule avec plus de pb"
Ou alors, c'est un relan d'instinct paternel :/

[invite468ec3f9]

Merci pour votre réponse. (je connais mon cours et ca fait longtemps que je cherchais la réponse à ma question). ce que je ne comprenais pas c'est que dans mon énoncé on me parle d'un plasmide et non d'une cellule. "on a digéré le plasmide pBR322 par différentes enzymes de restriction...." et donc je ne comprends pas le raisonnement pour un plasmide ou ca n'existe que sous forme de cellule ?

[piwi]

Un plasmide n'est pas une cellule! C'est un fragment petit d'ADN circulaire doté d'une capacité autoréplicative. Faire cette erreur c'est un peu comme confondre un chromosome avec une cellule...

[invite468ec3f9]

Je me suis mal exprime.
ce que j'ai voulu dire c'est est ce que l'on peut manipulé 1 plasmide tout seul ou alors faur til manipuler une cellule contenant des plasmides ?
parce que un plasmide tout seul non digéré ne devrait pas migrer en donnat plusieurs bandes. c'est que si il y a plusieurs type de plasmides qui cohabitent dans une même cellule

[invitee863e61a]

Un plasmide n'est pas une cellule! C'est un fragment petit d'ADN circulaire doté d'une capacité autoréplicative. Faire cette erreur c'est un peu comme confondre un chromosome avec une cellule...

Pour chipoter, certains plasmides sont plus grands que des génomes de bactéries...

[invitee863e61a]

Je me suis mal exprime.
ce que j'ai voulu dire c'est est ce que l'on peut manipulé 1 plasmide tout seul ou alors faur til manipuler une cellule contenant des plasmides ?
parce que un plasmide tout seul non digéré ne devrait pas migrer en donnat plusieurs bandes. c'est que si il y a plusieurs type de plasmides qui cohabitent dans une même cellule

Oui mais quand tu extraits les plasmides, tu obtiens toutes les formes à la fois, qui sont strictement identiques au niveau de la séquence. Tu digères aussi toutes les formes et globalement, l'existence de ces formes n'empêche pas les manipulations de biologie moléculaire.
Je repète que pour des raisons expliquées au dessus, il est normal qu'un plasmide non digéré migre en donnant plusieurs bande, même si les différentes bandes correspondent à la même molécule.

[invite17a570c1]

Je me suis mal exprime.
ce que j'ai voulu dire c'est est ce que l'on peut manipulé 1 plasmide tout seul ou alors faur til manipuler une cellule contenant des plasmides ?
parce que un plasmide tout seul non digéré ne devrait pas migrer en donnat plusieurs bandes. c'est que si il y a plusieurs type de plasmides qui cohabitent dans une même cellule

Mais moi, ce que je ne pige pas dans ta question, c'est combien de cellules je manipule pour avoir la quantité suffisante de plasmides avec lesquels faire joujou? Je manipule une cellule?

Réfléchis un peu là-dessus quand même...

Cordialement,

[invitee863e61a]

Mais moi, ce que je ne pige pas dans ta question, c'est combien de cellules je manipule pour avoir la quantité suffisante de plasmides avec lesquels faire joujou? Je manipule une cellule?

Réfléchis un peu là-dessus quand même...

Cordialement,

Les plasmides existent sous plusieurs forme même dans une même cellule.

[invite468ec3f9]

oui effectivement
mais dans ce cas, si je fais agir une enzyme de restriction qui n'a qu'un site de restriction sur le plasmide il faut que la digestion soit complète pour que je n'obtienne que des fragements de même taille et même volume.

[invite17a570c1]

Les plasmides existent sous plusieurs forme même dans une même cellule.

On est d'accord. Mais vu que la question pose un sacré problème, je me contentais de prendre les choses à un niveau assez basique.
Si j'ai un plasmide/cellule et que je manipule une cellule, j'aurai une bande correspondant à mon seul plasmide (pôv' malheureux solitaire...).
Mais comme ces choses exceptionnelles ne se produisent, on peut estimer qu'on a affaire à plusieurs plasmides, car on manipule plusieurs cellules, donc on aura affaire à une quantité de topologies différente de 1... D'où le nombre de bandes différent de 1 dans le puits 1 (pBR non digéré).

oui effectivement
mais dans ce cas, si je fais agir une enzyme de restriction qui n'a qu'un site de restriction sur le plasmide il faut que la digestion soit complète pour que je n'obtienne que des fragements de même taille et même volume.

Pourquoi parle-t-on de volume? Si je coupe en un site de restriction unique, j'aurai une molécule linéaire, càd que mon plasmide circulaire du départ sera devenu linéaire. Là, il n'y a plus de considérations de topologie.

Cordialement,

[invitee863e61a]

oui effectivement
mais dans ce cas, si je fais agir une enzyme de restriction qui n'a qu'un site de restriction sur le plasmide il faut que la digestion soit complète pour que je n'obtienne que des fragements de même taille et même volume.

S'il n'y a qu'un site, oui, effectivement. En général, les digestions fonctionnent bien et toute les molécules sont digérées. Il en reste probablement un peu non digérées mais trop peu pour être visualisée.

[invite44f8195c]

Bonjour,
j'aurais juste une question supplémentaire à propos de cette discussion:
j'ai fais migrer ma prep plasmidique "brute" (sans digestion préalable)et j'ai 5 bandes, mais la plus haute correspond à une taille de 5kb et la plus basse de 5kb.
je pense que ce sont les différentes formes de mon plasmides mais d'habitude je n'avais pas autant d'écart entre les 2 extrèmes (mais j'n'avais pas autant de bandes non plus, donc...).
je voudrais juste être sûre que c'est possible en fait.

(et avant que vous ne me le suggeriez, j'aurais volontier fait une digestion mais mon labo se met juste à la bio mol et on n'en a pas en stock donc si je pouvais m'éviter les délais d'une commande-livraison...)

merci d'avance!

[invitec2084a0d]

coucou
apropos de ce sujet ,dans un profil d'electrophorese comment on arrive a distinguer entre une bande qui correspond a un plasmide ,ou a un chromosome,,???
MERCI