électrophorèse-Gel-Activité?

[merins]

Bonjour tout le monde ;

Lors de la préparation du gel de polyacrylamide (pour l’électrophorèse) on verse le gel inférieur (à l’état liquide) entre les deux plaques de verre puis le gel supérieure (à l’état liquide aussi),

Les deux gels ne risquent pas de se mélanger ?



Comment l’électrophorèse sert à déterminer l’activité de la protéine (par exemple de la béta-gal) ?

Merci d’avance.
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[Elendilmir]

Les gels ne se mélangent pas car quand on coule le premier, le gel de séparation, on attend qu'il prenne avant de couler le second, le gel de concentration.

Il y a aussi le truc de déposer environ 500µl d'eau distillée ou d'isopropanol à la surface du gel de séparation pour que la surface soit bien plane (non ça ne se mélange pas non plus), puis on attend que ça prenne => en général on garde un peu de mixture dans un falcon pour savoir si ça a pris, puis on enlève l'eau ou l'isopropanol, on sèche un peu et là, on coule le second, en posant les peignes.

Pour l'activité, je suis pas sûre de comprendre, donc je laisse à qqn d'autre.


El.

[Yoyo]

l'electrophorese ne permet pas de determiner l'activité d'une enzyme (sauf cas particulier ou le substrat est mélangé au gel) elle permet en revanche de s'assurer de la presence de l'enzyme (apres cette derniere peut etre inactive).

YOyo

[merins]

Salut,

le gel qu'on a utilisé ne contient pas le substrat de la béta-gal, mais dans l'étape de la révélation on à utilisé un substrat chromogène qui vas s'associer à la béta-gal,

est ce que cette méthode vas nous conduire à la détermination de l'activité de la béta-gal?

(moi je pense que cette méthode ne nous permet que de determiner le poids moléculaire de l'enzyme),

Merci d'avance.

[A voir en vidéo sur Futura]

[MaliciaR]

Mais tu parles de quelle méthode?
Sur le gel tu fais migrer ton mélange afin d'être sûr d'avoir ta protéine dedans (=est-ce que je l'ai bien isolée ou pas), mais comme le plus souvent c'est un gel dénaturant, elle ne sera plus active.
Ensuite, le test d'activité enzymatique est justement pour t'assurer que ta protéine est vraiment là et que je n'ai pas isolé une autre avec le même PM.
Donc, clarifie tes questions au possible, sinon on ne comprend rien...

Cordialement,