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calcul activité enzymatique



  1. #1
    Mims69

    calcul activité enzymatique

    Bonjjour, je passe des partiels prochainement et je voulais savoir si mes exerces étaient correcte j'ai trouvé un annale que j'ai essayer de faire
    vous trouver le sujet ci joint

    On souhaite purifier une enzyme a partir d'un extrait cellulaire sur une colonne de DEAE fractogel
    l'élution est réalisée avec un gradient de NacL de 0 à 0,15. on récolte des fractions de 3ml

    On réaliser une mesure enzymatique de chaque fraction en introduisant 10 µL d'enzyme avec du pnitrophenyl acetate comme substrat du pnitrophénol se forme.

    A quelle longueur d'onde réalise t-on le dosage ?

    1. On choisit de faire le dosage à 420 nm car seul le produit absorbe et pour laquelle l'absorbance est maximale.

    On rassemble les fractions ayant les plus forte activités enzymatique

    Déterminer l'activité enzymatique totale pour l'ensemble des fractions J'ai séléectionné les fractions 27, 28, 29 donc en faisant un pool on obtient 9ml

    Je ne sais pas si il faut calculer l'activité enzymatique pour chaque fractions et les additionnées ou si on peut se permettre de faire une moyenne
    de variation d'absorbance pour les 3, voici mon calcul

    j'additionne les valeurs d'absorance maximale censé contenir notre enzyme.

    [A27 + A28 + A29]/εp-nitro]x volume du pool des fractions

    [(0,5 + 0,9+ 0,65)/ 15 000] X 9ml = 1,23µmol.min-1

    Puis pour calculer l'activité enzymatique totale, on fait
    AE x (volume de l'extrait/volume mesure)
    donc 1,23µmol.min-1 X (9ml/30µmol) = 369µmol.min-1

    merci

    -----

    Images attachées Images attachées

  2. #2
    Mims69

    Re : calcul activité enzymatique

    Quant à la suite de l'exercice ,je voulais avoir des avis sur l'interpretation

    une electrophorese est réalisé avec différent echantillon contenant l'enzyme

    Que permet de réveler d'acétate de naphtol?
    Il permet de réveler la presence de l'enzyme, en effet l'enzyme clive son substrat en un produit.
    Le produit formée peut réagir avec le fast blue RR visible par une tache.
    Donc la coloration indique la présence de la réaction et donc de l'enzyme.

    Pour la migration correspondant à l'extrait
    on observe deux larges bandes de migrations de vitesses differentes. ce type d'electrophorese sépare les molécules en fonctions de leur taille.
    plus une molécule migre loin plus elle est petite.
    Donc dans ce puits de migrations il y a deux enzymes de tailles différentes pouvant cliver le meme substrat.

    Dans le puits contenant la fraction 28, on observe une seule tache de migrations, migrant a la meme vitesse que celle de la premiere tache de l'extrait
    il s'agit de l'esterase, et indique que notre enzyme à bien été purifié

    le puits contenant la fraction 33 contient une tache migrant a la meme vitesse que celle de la seconde tache de l'extrait
    c'est une enzyme capable de cliver le meme substrat que l'esterase mais qui est éluée à une concentration en sel superieure à celle de l'esterase

  3. #3
    kamiBio

    Re : calcul activité enzymatique

    SVP j'ai pas bien compris comme t'as calculé l"activité totale??? moi j'essaye de la calculer sachant que j ai le volume, l'activité (UI/ml), protéines( mg/ml) AS (UI/mg) taux de purification et la je cherche le rendement! qui est calculé par activité totale que j'arrive pas à trouver!! SVP pouvez vous m'expliquer?? merciii

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