Bonjour,
Je cherche à doser l'activité d'une enzyme impliquer dans l'amylolyse. Je travaille sur des bouilles de farine que je resuspend dans du sérum physiologique. J'ai besoin de centrifuger à 10 000g et je me demande si je ne précipite pas mon enzyme d'intérêt. Comme je n'ai aucune expérience en protéine/enzymo je sollicite votre aide!
merci d'avance
Connaissez vous votre enzyme? Dans ce cas là, pourquoi ne pas essayer de faire une cinétique sur le surnageant avec le subtrat de l'enzyme (détectable au spectrophotomètre) puis sur celui du culot ressolubilisé? (pour voir si votre enzyme ne s'est pas retrouver dans le culot.)
Oui très bonne idée ! Cependant, en théorie les protéines en général ne précipitent pas spontanément dans du sérum physiologique, même apres centrifugation. Elle peut par contre être adsorbée sur un composé qui lui se retrouve dans le culot. A vérifier comme le suggère Vilcrocrotte. Si vous avez un anticorps c'est aussi possible par western blot.
Effectivement je connais les activités enzymatiques théoriques, il s'agit des activités glycogen phosphorylase, matltose phosphorylase, et enfn neopullulanase.
Ca me rassure si les protéines ne précipite pas dans du sérum physiologique, c'est déja une très bon point à vrai dire. Par contre il est quasiment impossible de solubiliser le culot et même de le pipetter(c'est de l'amidon bien pateux style maizena en plus compacte) a moins de chauffer fortement, ce qui a mon avis va alterer l'activité enzymatique. Pour ce qui est des anticorps j'avais déja penser à cette solution malheuresement je ne connais pas de fournisseur qui commercialise des anticorps spécifiques de ces protéines.
En tout cas merci pour précédentes réponses, si vous avez d'autre indice n'hésiter pas à m'en faire profiter!
Et en changeant le pH avec du NaOH et HCl de manière à le/les solubiliser, ce n'est pas possible? Bon après, c'est sur qu'on risque de toucher à l'activité enzymatique...
Et le SDS PAGE? Bon, ça risque d'être cafouilli dans les résultats mais si vous connaissez le poids moléculaire de vos enzymes, vous pouvez savoir si dans votre culot ou votre surnageant, vous avez vos protéines.
En plus, vous pouvez utiliser le chauffage pour solubiliser le culot sans soucis puisqu'une étape de chauffage est nécessaire pour incorporer le colorant entre les protéines
Malheuresement leur activité est très dépendante du pH (d'après la littérature) donc ce n'est pas possible sniff...
Le SDS page pourrait etre une solution intéressante mais comme tu le dit c'est assez galère à interpréter! J'ai bien une idée du poids moléculaire des enzymes mais comment etre certain que les bandes observées correspondent bien à mon enzyme (pas d'anticorps). Je dit peut etre un betise mais "le séquencage" de protéine peut etre onéreux pour l'info qu'on en tire?
Oui je le sais mais juste changer le pH le temps de les solubiliser puis ensuite les remettre à leur pH fonctionnel. Ce n'est pas possible? ça ferai une dénaturation irreversible au niveau de la fonction enzymatique?
Alors la tu pose une colle! j'avoue que je n'en ai aucune idée. Je vais essayer ca mais je ne sais pas si ca va fonctionner, je vais essayer un pH acide et basique je tiens au courant, merci de ton aide
Le problème du pH c'est qu'il peut aussi hydrolyser certains ponts peptidiques si je ne dis pas de bêtise. Ajouté au changement de conformation dû au changement de charge des radicaux R, ça diminue d'autant les chances de retrouver la structure tertiaire/quaternaire version d'origine.
Même chose pour le chauffage.
Quant à savoir si un site d'action reste fonctionnel, seules l'expérience et un brin d'intuition permettent de le prédire.
Il ne reste plus qu'a faire des tests, j'espère que cela fonctionnera!
malgré que j'ai eu un 16/20 en biochimie générale je ne peut dire que "la biochimie c'est de la cuisine" (j'ai mis entre parenthèse car c'est pas moi qui a dis ça c'est mon prof)...si en s'y connais en cuisine forcément en deviens un bon biochimiste hélas j'ai pas fait Biochimie lol...
bon courage.
