Activité enzymatique
La précipitation au sulfate d'ammunium permet la concentration de l'activité enzymatique.Cependant, si on passe d'un volumé de filtrat de culture de 50 ml à un précipité de 5ml, on concentre 10 fois notre échantillon. Normalement on doit obtenir une activité enzymatique multiplié par 10 ( en théorie).
Personnelement je ne réussit qu'à tripler cette valeur!!!!
Comment explique celà?
Y a t-il des solutions pour diminuer les pertes???
Merci
Bonjour.
L'activité enzymatique n'est pas une quantité. L'activité enzymatique est donnée par une enzyme. Ce que vous faites varier c'est la concentration de l'enzyme.
Maintenant à chaque étape de purification vous avez des pertes qui peuvent être importantes. Ces pertes peuvent varier selon les étapes que vous appliquez.
Je conclue en disant qu'il est normal que vous n'ayez pas un rendement maximal. Maintenant comment évaluer vos pertes? Aucune idée. Comment précipitez vous vos protéines?
Cordialement,
piwi
Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.
La précipitation se fait par sulfate d'ammunium à une concentration de 80%Envoyé par piwi
L'activité enzymatique est dosée en premier lieu au niveau du filtrat de culture (50 ml de culture) et puis ensuite aprés avoir précipité ces 50 ml pour aboutir à la fin a 5ml de précipité.
Normalement l'activité enzymatique correspand au nombre de micromoles dégradé du substrat par millilitre et par minute.
Salut
Pour moi, il y a quelques problèmes !!!
Déja quand tu parles d'activité enzymatique, tu veux parler d'activité catalytique ou activité spécifique ? Je pense que tu parles d'activité catalytique en mon avis !!!
Ensuite si j'ai bien compris, ton objectif est de concentré ta protéine ?
Donc tu fais une precipitation au Sulfate d'ammo, c'est quoi en détail ton protocole ? Peux tu doser la quantité de protéine avant et après precipitation ? Tes conditions expérimentales de mesure de cinétique sont elles identiques avant et après précipitation ?
a+
Je parle de l'activité catalytique et qui est exprimé en Unité internationale.
Je dose mes protéines avant et aprés précipitation via la méthode de lowry en gardant tjrs les memes conditions expérimentales
Votre concentration d'ammonium sulfate est de 80% stock ou final?
Vous l'ajoutez goutte à goutte ou en bloc? Attendez vous quelques minutes avant de centrifuger?
Ces quelques paramètres peuvent influencer la qualité de votre précipitation.
Cordialement,
piwi
Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.
J ajoute le sulfate d'ammo en petites quantités et je laisse précipiter pendant une nuit avant de centrifuger
Ok ca semble pas mal. Mais vous êtes certain que votre protéine précipite à 80% de saturation? Vous avez essayé 85% ou 90%?
Si cela se trouve vous êtes au seuil de sa précipitation et seulement une partie cristallise alors que le reste est encore en solution.
Avez vous testé l'activité spécifique du surnageant?
Cordialement,
piwi
Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.
Il faudrai également savoir, si la précipitation n'endommage pas la protéine et donc si il n'y a pas une perte d'activité catalytique. Pour cela il faudrai determiner l'activité spécifique, avant et après précipitation.
a+
