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plamide repris en EDTA et digetion enzymatique



  1. #1
    schloomm

    plamide repris en EDTA et digetion enzymatique

    Bonjour,

    J'ai extrait un plasmide que j'ai repris dans du tris-EDTA. Ensuite, j'ai digéré celui-ci par une enzyme de restriction mais mon ADN est complètement dégradé. Après avoir fait des tests, des vérifs et de la lecture, il s'avère qu'il ne faut pas de présence d'EDTA pour une digestion enzymatique.

    Pourquoi? Je croyais bien faire, protéger mon ADN.

    -----


  2. #2
    jmbowie

    Re : plamide repris en EDTA et digetion enzymatique

    Bonsoir,


    De quelle enzyme s'agit t'il ? Certaines présentent une activité "STAR" qui correspond à une reconnaissance anormale de sites liée à une perte de sélectivité. Pour l'éviter il faut éviter de travailler avec un excès de sel ou une durée d'incubation trop longue mais d'autres paramètres ont une influence, peut-être que la concentration en EDTA peut jouer. Comme l'EDTA est un chélateur de cations divalents, possible qu'il titre le Mg2+, Ca2+ etc de votre tampon et entraîne l'activité "STAR"
    Perso j'élue ou reprends toujours l'ADN dans de l'eau distillée et stérilisée
    Blast up your life!

  3. #3
    schloomm

    Re : plamide repris en EDTA et digetion enzymatique

    Bonjour,

    Je digère avec l'enzyme NotI et j'utilise un TE 4:0.2. J'ai repris en eau et effectivement je n'ai plus de problème.
    J'ai fait un test: j'ai refait une digestion avec le plasmide repris en EDTA mais je n'ai pas mis d'enzyme. Résultat: mon ADN est dégradé par le tampon, je l'ai fait avec les kits de deux fournisseurs. Il ne s'agit donc pas d'activité STAR, car il n'y pas d'enzyme. C'est une interaction entre l'EDTA et le tampon.
    La solution est de reprendre en eau, c'était juste pour comprendre...

    Merci pour votre réponse.

    Bonne continuation

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