Anticorps WB ou ICC

[Agabiem]

Bonjour,

désolée si cette discussion a été abordée auparavant mais je n'ai pas trouvé de fil de discussion correspondant.
Je souhaiterais savoir pourquoi un anticoprs primaire est susceptible de marcher pour de l'immunohisto/cytochimie mais pas en western blot ?

En effet, j'ai un anticorps primaire (cadeau d'un autre labo) qui fonctionne en ICC mais quand j'ai voulu faire un WB, je n'avais aucun signal spécifique... Après un petit coup de bibliographie, ils'est avéré que cet Ac n'avait jamais été utilisé lors des WB, et même dans une publi où il était utilisé pour de l'ICC, l'équipe avait utilisé un Ac commercial dirigé contre les mêmes aa de la protéine cible pour faire le WB. Et après un contact avec un membre de l'équipe, il m'a été répondu que cet Ac effectivement ne fonctionnait pas en WB...

Merci d'avance pour vos réponses !!
-----

[Flyingbike]

Parce que l'accessibilité des protéines est très différente entre un contexte d'organisation cellulaire "intact" (ICC) et des protéines beaucoup plus accessibles comme sur une membrane (WB).

De plus, dans un WB on dénature souvent les protéines, ce qui n'est pas toujours le cas en ICC, ce qui modifie aussi l'accessibilité des protéines pour les anticorps.

Dernière chose, les résultats sont très différents selon qu'on produit des anticorps dirigés contre une protéine totale ("a l'ancienne") ou contre un fragment synthétisé.

[Agabiem]

Justement, étant donné que l'on dénature avant le dépôt sur gel, la protéine permet sa conformation 3D, le fragment devrait donc être plus accessible ?
Je suis désolée, je suis une buse en biomol...
En fait ma protéine fait 980aa (107kD). Et l'Ac est dirigé contre les résidus 1 à 18... Est-ce ça que vous appelez "fragment synthétisé" ?

Si je supprime l'étape chauffage, serait-il possible de ne plus avoir ce problème ? Et le bétamercapto dans le laemmli ?

[Enialix]

Bonjour,

Il faudrait faire un gel natif dans ce cas, car le SDS va aussi denaturer ta proteine.

[A voir en vidéo sur Futura]