bonjour,
Je fais une étude de diversité génétique, en me basant sur le polymorphisme de marqueurs microsat...
bref, casse la tienne, il faut tout d'abord avoir amplifié ces microsatellites, ce qui est... comment dire... déjà ma plus grosse bataille
15 couples de primers, et chacun ses petits caprices. J'optimise au max les conditions de PCR pour chacun d'entre eux
j'entends différents sons de cloche à propos des Tm et Ta, sensibilité, spécificité...
voilà ce que j'en retiens, et je suis preneuse de vos avis:
- admettons une Tm à 54°C (pour les amorces F et R), Température où la moitié des amorces sont monocaténaires et l'autre moitié s'hybride
- pour une PCR où la Ta< Tm , les amorces tendent à reformer des liaisons et "se lier avec ce qu'elles peuvent", donc peuvent s'hybrider avec l'ADN avec bcp moins de spécificité
--> d'où amplif non spécifique
- pour une PCR avec Ta> Tm, les amorces lorsqu'elles se fixent (car Température où il y a + de brins qui tendent à être monocaténaires que bicaténaires), s'hybrident avec + de spécificité, en particulier avec leur site spécifique de fixation de l'ADN--> du coup, plus de spécificité mais moins de rendement
donc moins de rendement pour une PCR à Ta=56°C mais au moins, la bonne bande amplifiée, et de l'amplif non spé à Ta=52°C même si le rendement est pas trop mal
certes, dans la pratique, c'est loin d'être aussi "binaire", mais je voudrais savoir si la façon de se visualiser ce qui se passe est déjà bonne?
merci d'avance
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