qPCR : Pourquoi soutraire le CT values et pas les diviser

[invite27c4ff3b]

Salut pourquoi soustrait t-on la CT value du control à celle du GOI au lieu de la diviser comme on fait pour quantifier un WB ? On me dit et je lis que c'est parce que les CT value sont des valeurs exponentielles (déjà on voit pas en quoi puisque la CT correspond à l'abscisse c'est à dire au nombre de cycles où la phase exponentielle est atteinte) mais je vois pas en quoi ca empêche de diviser pour normaliser. Bref j'aimerais l'explication mathématique précise, vous savez où je peux la trouver ?

Merci !
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[Flyingbike]

C'est pas compliqué
En PCRq on raisonne en concentrations

Entre un ct de x et un ct de x+1, la concentration passe de c a c/2

donc pour un ∆ct de 1, on a un doublement de la concentration.

La relation entre ct et concentration n'est pas linéaire, sinon on aurait par exemple 2 fois plus de matériel avec un Ct de 14 que pour un Ct de 28, alors qu'en réalité la différence est de 2^14.

[invite43cccb18]

Salut,

La méthode de référence pour traiter les donnés de qPCR est très bien expliquée dans cette publi:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11846609

C'est basé sur le principe que FlyingBike a donné. Tu y trouveras toutes les équations et explications nécessaires.

Bob

[invite43cccb18]

...je peux plus corriger, alors j ajoute...

On soustrait les Ct parce que c'est une division de 2^Ct par un 2^Ct. La simplification de l'équation conduit (en très bref) à un 2^-dCt.
Dans la publi que j'ai mise en lien, l'équation exacte (qu'en théorie on est pas sensé simplifier par un 2 est un peu plus compliquée et fait intervenir les efficacités respectives de tes couples de primers)

l'équation ressemble à ca pour le 2^-ddCt:
(X0/R0)/(X0cb/R0cb)
cb pour condition de controle

X0/R0 c'est
((1+eff couple primer calibration)^Ct condition1 primer calibration)/(1+eff gene étudié)^Ct gene étudié condition1))

Si tu as des efficacités de 100% (ce qui n'arrive pas très souvent), tu as 1+1, donc 2^, et la tu as l'explication de la division de Ct qui deviens une soustraction (2^Ct1/2^Ct2)=2^(Ct2-Ct1)
soit 2^(-(Ct1-Ct2)) => 2^-dCt

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite27c4ff3b]

oui j'ai lu ces publies mais bon on a l'impression qu'ils essaient de péter plus haut que leurs culs dans la mesure où tout ce qu'ils font c'est bel et bien diviser la quantité du GOI par celle du GAPDH comme dans un WB mais sans expliquer le raisonnement à partir du début. Ils parlent de modèles mathématiques et tout comme s'ils avaient réinventé la roue mdr.

J'ai compris par moi même finalement, en fait on divise bien la quantité du gène cible par le control (gapdh par ex), c'est juste qu'on a pas accès aux quantités mais aux CT qui sont des fonctions exponentielles de la quantité.

Si on pose In l'intensité du volume réactionnel au cycle n, I0 la quantité initiale de cDNA et E l'efficacité de la reaction (2 en général, c'est à dire un doublement de la quantité de DNA à chaque cycle) on à l'équation suivante :

In=I0*E^n

Donc au treshold on a :

Th=I0*E^CT

Et comme ce qui nous intéresse est la quantité de cDNA reliée à celle de RNA on a :

I0=Th/E^CT

Maintenant si on divise I0 du gène cible par I0 du gapdh, en simplifiant le tout on a le ratio R, qui est la quantité de cDNA normalisée par GAPDH :

E^(CT_GAPDH-CT_GOI)

Ensuite on divise les quantités normalisées pour voir l'expression relative sur le même principe on obtient le delta_detlaCT :

E^[(CT_GAPDH-CT_GOI1)-(CT_GAPDH-CT_GOI2)]

[invite853321bf]

Si on pose In l'intensité du volume réactionnel au cycle n, I0 la quantité initiale de cDNA et E l'efficacité de la reaction (2 en général, c'est à dire un doublement de la quantité de DNA à chaque cycle) on à l'équation suivante :

In=I0*E^n

En fait l'équation est plutôt présenté :

In=I0*2E^n

Car 2 n'est pas général, mais théorique (si seulement ). Et l'efficacité est présenté comme un pourcentage.

[invite43cccb18]

E^[(CT_GAPDH-CT_GOI1)-(CT_GAPDH-CT_GOI2)]

OUI!!!!

C'est très exactement ce que j'ai expliqué dans mon post (avec d'autres lettres, et en plus exact), et aussi dans le post de FlyingBike

[invite27c4ff3b]

je vois pas en quoi c'est plus précis c'est surtout inutilement plus compliqué pourquoi se faire chier avec des calibrations ou je sais pas quoi alors que je viens de démontrer la formule à partir du début.

Sinon c'est bien In=I0E^n car E est défini comme le coefficient multiplicateur d'intensité d'un cycle à l'autre

[invite43cccb18]

Je te conseille de ne pas montrer des résultats traités avec une équation simplifiée comme tu l'as écrite à quelqu'un de spécialisé dans l'expression génique.

La méthode décrite dans le papier dont tu penses que les auteurs veulent

péter plus haut que leurs culs

est la méthode de référence, que l'on soutient en plus par des tests statistiques, pour présenter des résultats publiable auprès de la communauté scientifique. Après tu es en droit de penser ce que tu souhaites.

Pour chaque couple de primer, il est demandé (mais surtout indispensable) de faire une courbe d'efficacité, qui est rarement de 100%. Et c'est pourquoi une tolérance de 10-15% est acceptée (85% à 115% d'efficacité, sinon tu peux jeter tes primers). Il y a de nombreuses publi, notamment dans Nature, sur comment faire de la qPCR de qualité ("10 golden rules for qPCR" en autres...).
Si tu ne fais pas ces courbes d'efficacité, tu n'as pas le droit de simplifier ton équation. De plus, des primers n'ayant pas les mêmes efficacités ne peuvent en aucun cas être comparés si tu ne fais pas intervenir ces facteurs de corrections (et encore les puristes n'aiment pas ça). Lorsque cela est quand même fait dans certaines publi, celles-ci passent vraiment pour de la merde auprès des personnes du domaine.

Personnellement, si mes étudiants m'avaient donné des résultats traités de la sorte, je ne les aurais juste pas regardé car ils conduisent à énormément de fausses interprétations. C'est également l'avis de personnes que je connais qui bossent chez Applied Biosystem et qui ont à une époque tenu la hotline pour la qPCR...

Maintenant, libre à toi de croire ce qui t'arrange et de remettre en questions les publications de référence.

Bob

[invite27c4ff3b]

mon problème n'est pas qu'ils cherchent à faire des formules plus précises pour que les résultats aient une valeur statistique définie mais qu'ils ne partent pas du départ pour expliquer les formules. Je suis désolé mais ni dans ton papier ni dans celui de Pfaffl je n'ai vu l'équation initiale In=I0*2E^n à partir de laquelle on explique qu'on divise le I0_GOI par I0_GAPDH pour normaliser par la quantité de gapdh or c'est précisément ce qui me manquait pour comprendre la formule finale à laquelle j'avais accès et que j'essayais de comprendre.

[invite43cccb18]

Oui, c'est vrai que c'est dommage et dommageable qu'ils ne le réexpliquent pas. Ça vient de la théorie de la qPCR. Il n'est pas possible de prédire l'efficacité de la RT sur les échantillons, donc il faut un gène de référence qui est (en théorie) exprimé de la même façon dans toutes le conditions et qui permet de normaliser les quantités d'ADNc (comme tu le sais). Puis à nouveau une nouvelle normalisation mais par rapport à l'échantillon contrôle.
Ça leur semble tellement évident qu'ils ne le re-précisent pas...

pourquoi soustrait t-on la CT value du control à celle du GOI au lieu de la diviser comme on fait pour quantifier un WB ?

Je pensais que tu avais seulement un soucis à propos d'une division qui "devient" une soustraction. Désolé pour la mésentente.

Par ailleur, tu retrouves cette histoire de gène de calibration dans cette formule

((1+eff couple primer calibration)^Ct condition1 primer calibration)/(1+eff gene étudié)^Ct gene étudié condition1))

Qui se divise ensuite par la même équation mais pour la condition contrôle.

Bob