Purification de sous-unités ribosomiques

[rob-zombie]

Bonsoir,
je suis en train de purifier des ribosomes pour ensuite étudier leur stabilité. J'ai commencé par des ribosomes entiers d'E. Coli taggués avec 6 histidines sur la grande sous-unité sans trop de problèmes. En calorimétrie j'ai obtenu de bons résultats mais relativement complexes (des pics qui se recouvraient...). Pour approfondir un peu j'ai essayé de séparer les sous-unités pour y voir plus clair en re-purifiant mes ribosomes sur la même colonne (Ni-NTA) et en baissant la quantité de magnésium dans mon tampon (de 10mM à 1mM) par dialyse. Le problème c'est que du coup j'ai plus aucun pic de dénaturation en calorimétrie ni sur la sous-unité 30S ni sur la 50S, comme si elles étaient déjà dégradées. J'utilise du NDSB-201 à 1M pour éviter l'aggrégation dans le calorimètre.
Le problème vient peut-être du tampon (Tris-HCl 20mM, MgCl2 1mM, KCl 150mM et NH4Cl 30mM) mais j'ai pas réussi à trouver si les sous-unités séparées ont besoin d'un tampon particulier de stockage/utilisation
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[Yoyo]

Salut

Les sous unités séparées vont spontanément se réassocier. Si tu n'as plus de Mg2+ elles resteront séparées, mais ce n'est pas impossible que tu perdes des protéines qui elles aussi ont besoin de Mg2+.
Pourquoi passes tu par une purification sur Ni2+? un traitement à la puromycine avec un tampon sans Mg2+ sur un gradient de sucrose te permettra de récupérer de belles sous-unités séparées sans aucun marquage au préalable. Donc si ta protéine taggée se détache cela n'empeche pas la purification des sous-unités


Yoyo

[rob-zombie]

Je t'avoues que je sais pas trop. En fait mon maitre de stage avait au préalable taggué la protéine L7 comme c'est expliqué là : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19074194. ça te donne des ribosomes intacts et fonctionnels et faciles à purifier (le rinçage avec 20mM d'imidazole fait couler toutes les autres protéines et après élution avec 150 mM pour récupérer les ribosomes).
Ensuite on a voulu séparer les sous-unités en baissant le taux de Mg et en repassant sur la colonne, la grande ssu est retenue mais pas la petite. On a vérifié sur gel et ça marche pas mal mais après en calorimétrie, aucun pic comme avec les ribosomes entiers (dans les mêmes conditions). Du coup je me demandais si hormis le Mg il fallait pas des conditions particulières pour les sous-unités ?

[Yoyo]

Ah ok vous devez avoir des mutants des protéines ribosomales et ne vouloir purifier que ceux la.
Sinon pour répondre à ta question, non a priori il faut du Mg2+, moi j'utilise que de l'acetate je trouve que les sous unités restent mieux intacte qu'avec les chlorures. Mais tu trouves des chlorures dans tous les protocoles.
Yoyo

[A voir en vidéo sur Futura]