qPCR : Ct tardif

[invitee170a0e7]

Bonsoir à tous,

Je vous expose mon soucis de la fin de journée
Je fais de temps en temps de la qPCR pour déterminer l'expression relative de mes gènes (de signalisation, faiblement exprimés) dans des conditions déterminées.

Problème : dans une condition X les Ct sortent très tardivement (>32), et dans une condition Y c'est l'inverse (dès 5 , ou alors c'est le seuil qui est trop bas ?).

Il se trouve que les ARN de la condition X étaient assez faible (mais propre) : 0,2ug/ul
Et pour Y aussi (mais plus élevé quand même) : 0,6ug/ul

Pour ma RT, je pars de 2ug (dans un VF de 40).
Pour la qPCR, ma dilution est au 1/3.

Mon gène de ménage est nickel pour toutes les conditions. Je ne comprends pas pourquoi "comme par hasard", les conditions où les ARN étaient les plus faibles, ont des Ct pourris. Je part pourtant de 2ug, la RT est la même !

Là où ça se complique, c'est que je suis fortement limité en ARN pour X et Y... Je ne pourrais probablement pas en ravoir.
Initialement je pensais refaire une RT, et diluer qu'au 1/2 (voir pas) en qPCR : est-ce une bonne stratégie ? (de base, ça me plait moyennement car cela veut dire liquider tous mes ARN... ^^).

Sinon je pensais faire une pré-amplification de mes cDNA... de façon à avoir une matrice plus abondante pour la qPCR : est-ce que cela peut se faire ? Si oui comment ?

Autres idées ?

Merci
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[Flyingbike]

Problème : dans une condition X les Ct sortent très tardivement (>32), et dans une condition Y c'est l'inverse (dès 5 , ou alors c'est le seuil qui est trop bas ?).


dans les deux cas, il n'y a pas grand chose à en tirer :s


Il se trouve que les ARN de la condition X étaient assez faible (mais propre) : 0,2ug/ul
Et pour Y aussi (mais plus élevé quand même) : 0,6ug/ul

ca ne me choque pas. Qu'est ce que tu entends par "propre" ?


Mon gène de ménage est nickel pour toutes les conditions. Je ne comprends pas pourquoi "comme par hasard", les conditions où les ARN étaient les plus faibles, ont des Ct pourris. Je part pourtant de 2ug, la RT est la même !

quel est-il, ce gène de ménage ?

Là où ça se complique, c'est que je suis fortement limité en ARN pour X et Y... Je ne pourrais probablement pas en ravoir.
Initialement je pensais refaire une RT, et diluer qu'au 1/2 (voir pas) en qPCR : est-ce une bonne stratégie ? (de base, ça me plait moyennement car cela veut dire liquider tous mes ARN... ^^).

essayons d'éclaircir le probleme avant, c'est plus prudent

Sinon je pensais faire une pré-amplification de mes cDNA... de façon à avoir une matrice plus abondante pour la qPCR : est-ce que cela peut se faire ? Si oui comment ?


ca ne fait que déplacer le problème... et tu risque de perdre le coté "quantitatif"


bon courage

[invitee170a0e7]

Par propre, je sous-entend qu'ils ne sont pas dégradés (vérifier en dosant par spectro', et en visualisant sur gel).

Le gène de ménage que j'utilise c'est "RPS9" (40S ribosomal protein S9), plutôt fiable dans mes conditions.
Je pense que l'expression de mon gène d'intérêt est très très faible dans les conditions où ça déconne car RPS9 est dans les normes.

[Flyingbike]

en fait je te demandais cela par rapport a une dégradation éventuelle. Des fois un échantillon peut etre dégradé mais sans trop affecter la concentration en ARN 18S par exemple.

Mes conseils seront de mesurer l'expression d'autres gènes (genre actine, cyclophiline, GAPDH, des trucs bateau)

et également de regarder la courbe de fusion des produits de pcr, si ce n'est déjà fait.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitee170a0e7]

en fait je te demandais cela par rapport a une dégradation éventuelle. Des fois un échantillon peut etre dégradé mais sans trop affecter la concentration en ARN 18S par exemple.

Mes conseils seront de mesurer l'expression d'autres gènes (genre actine, cyclophiline, GAPDH, des trucs bateau)

et également de regarder la courbe de fusion des produits de pcr, si ce n'est déjà fait.

Merci des conseils je vais regarder ça, et je reviens pour dire ce qu'il en est