Bonjour,
est-ce que quelqu'un pourrait m'aider à comprendre "la nouvelle méthode de séquençage"?
(http://books.google.fr/books?ei=yrHR...HCN1cQwiagC&dq
=tommie+lee+andrews+profil+d%2 7ADN&q=338#v=snippet&q=338&f=f alse)
p.338
J'ai des problèmes à comprendre ce qu'est le but de cette méthode. Pour les sequençages enzymatique
et automatique j'ai compris comment on arrive à la séquence d'ADN analysé, mais dans ce cas-ci
je n'arrive pas à comprendre les étapes f,g,h.
Merci beaucoup d'avance.
Salut Valérie,
Voilà un lien direct vers la page 338 du Raven : Nouvelle méthode de séquençage
Honnêtement, je ne peux pas t'aider. La réponse à tes questions doit se trouver dans le texte, disons de la page 327 à la page 358.
Cordialement.
Bonjour,
et bien j'ai déjà lu le chapitre entier et essayé de comprendre moi-même, avec
internet et tout, mais je ne comprends tout simplement pas comment les paquets
de l'image f donnent la répartition de l'image g et pourquoi il y a des différents bases
aux bouts.
Merci quand-même
Salut
Sur l'image g, tu ne vois que la moitié des fragments (ceux qui ont leur 3' en vert), les primers ajoutés ne s'hybrident qu'à ces fragments de ssDNA. Chaque paquet possède des fragments qui sont complémentaires, puisqu'ils sont le résultat d'une amplification à partir d'un fragment d'ADN seulement.
Chaque paquet est séquencé en parallèle (la moitié des fragments de chaque paquet plus précisément). Les fragments d'un paquet insérent tous le même dNTP (du moins dans une certaine limite, dépendemment de la longeur des fragments). Pour chaque dNTP, une couleur est associée. Les paquets sont excités par un laser, émettent de la lumière via le fluorophore lié à la dernière dNTP insérée et une caméra CCD permet de lire la couleur de chaque paquet, ce qui te donne la dernière base insérée par les fragments de chaque paquet.
Ensuite, le fluorophore est clivé et une nouvelle base est ajoutée, etc... jusqu'à avoir synthétisé tout le brin complémentaire de chaque fragment. Pour chaque paquet, tu auras une séquence de couleur : bleu-vert-jaune-jaune-rouge .... , qui sera transformée en séquence nucléotidique GCTTA ....
J'ai expliqué en gros, ne sachant pas trop à quel niveau se situe ta difficulté, précise un peu ta question
Gordak
Bonsoir,
merci beaucoup. C'est déjà plus clair. En fait, un de mes problèmes
était que je ne comprenais pas que seulement la moitié des fragments
est représentée en g.
Pourtant j'ai encore un problème:
sur l'image g les fragments du paquet me semblent tous déjà entièrement
répliqués, mais j'ai cru qu'ils insèrent les dNTP pendant leur réplication, parce
que sinon on ne peut pas déterminer la séquence des fragments? Ou est-ce
qu'on coupe toujours les fragments avant d'ajouter tous les dNTP?
Je ne sais pas si j'explique bien mon problème....
Alors, il faut bien distinguer deux phases. La première phase est l'amplification des fragments, c'est le même principe qu'une PCR (les primers sont spécifiques à des adapters, séquences qui ont été ajoutées à chaque bout des fragments d'ADN). L'amplification des fragments est nécessaire pour obtenir un signal analysable (bon signal / noise ratio).
La deuxième phase, est la phase qui permet de séquencer les fragments. Certes l'ADN y est aussi amplifié, mais c'est n'est pas le but. Au début de cette phase, on ajoute seulement un type de primers, des dNTP et la polymérase. Les dNTP ont tous un fluorofore sur leur sucre, qui empêche l'ajout d'un autre nucléotide lors de la réplication. Donc, seul un nucléotide est ajouté à chaque fragment. Ensuite, on excite tous les paquets au laser, on lit la fluorescence et on clive le fluorophore. Une fois le flurophore clivé, on ajoute à nouveau la polymérase avec les dNTP labellés. Laser, lecture, clivage, etc...
Autrement dit, les fragments sont séquencés nucléotide par nucléotide.
Gordak
Un grand merci!
Je vois beaucoup plus clair maintenant.
