bonsoir,
j'ai fait séquencer mon produit de pcr, mais il y a une mutation qui me transforme l'acide aminé serine (polaire) en proline (apolaire). Faut il que je recommence mon clonage ou cela ne devrait pas trop changé la structure de la protéine?
merci d'avance à ceux qui me répondront rapidement
tu n'as obtenu qu'une seule colonie suite à ton clonage ?
Sinon repiques-en 5 ou 6 autres et séquence les. ensuite garde seulement les bonnes.
Si c'était ta seule colonie tu devrais recommencer. (en utilisant une un produit de PCR obtenu avec un taq high fidelity, mais j'imagine que c'était déjà le cas).
bonjour,
désolé pour toi mais je te conseille très fortement de recommencer....
parce que l'apparition d'une proline dans ta séquence va entrainer une cassure dans la structure secondaire de ta prot.
si tu avais une hélice alpha ou un feuillet beta, avec cette nouvelle proline, tu peux être sur que l'helice ou le feuillet saute.
désolé
salut
bon globablement vaudrait mieux recommencer, mais pas forcément non plus, ca depends un peude ce que tu veux faire avec ta proteine apres et ca depend aussi ou se situe la mutation dans la proteine. tu veux faire quoi?
Yoyo
ben en fait, je pense recommencer car je veux regarder sa localisation en GFP
D'un point de vue purement fonctionnel, la disparition de ta serine peut-être particulièrement dommagable si ta protéine est phosphorylable...........
A+
Vinc
Salut,
Il vaut mieux recommencer du debut (ou refaire le sequençage pour etre sur). Par contre, je ne jette pas ton clone, il peut etre interessant de determiner l'impact de cette mtation sur la fontion (ou localisation) de ta proteine...
A+
Envoyé par vanessa25
bonsoir,
Pro est un "casse-structure" donc c'est très défavorable,
à moins que la structure 3D de ta proteine soit déjà connue à 100%,
et encore pour une étude fonctionnelle c'est pas top...
quelques suggestions avant de reprendre cette PCR + clonage:
- quelle est la matrice servant pour cette PCR? 100% sure qu'elle est wt de séquence? que dit la biblio à propos de l'existence de variants/mutants naturels?
- as tu déjà ce fragment de PCR cloné dans un vecteur maniable (ex: TOPO, Bluescript etc)? si oui alors c'est peut-être encore plus simple de partir de cette construction comme matrice, et de l'utiliser pour remutagéniser Pro en Ser pour revenir à la séquence wt; voir kit Quick Change chez Stratagene ou équivalent.
courage!
on est tous passés par ce genre de gag,
l'essentiel c'est de s'en rendre compte dès le départ.
cheers,
Hiro
