Bonsoir,
J'utilise une concentration de primers dans une pcr classique à environ 10µM Pour le séquançage la concentration de ces même primers est à 3pM. Pensez-vous que le design des primers peut dépendre de la concentration de primers utilisés?
Je vous pose cette question parceque j'utilise un primer qui focntionne trés bien en PCR mais pas du tout en séquençage.
Merci pour vos réponses
Salut,
3pM pour le sequencage? Tu fais ton sequencage sur place ou c'est une boite qui s'occupe de ca? Je trouve quand mm cette concentration vraiment basse.
Par exemple la société à laquel je fais appel demande des amorces à 2µM.
Sinon le pb pendant seq est de quel type? Peut être que le pb ne vient pas de tes amorces...
Pour nous aussi le service de séquencage demande des amorces à 2µM. Le problème vient peut être d'une erreur dans les dilutions.
Cordialement,
piwi
Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.
J'utilise 3,2pM pour la concentration des amorces en séquençage. Je fais sa directement dans mon labo et j'ai déjà utilisé cette concentration pour d'autres amorces et sa marche bien. Le problème et que j'ai vraiment rien du tout en séquence avec ces amorces. Un autre collégues à eu le même problème avec ces mêmes amorces, ma bosse m'a demandé de dessiner d'autres amorces, trés bien je vais le faire! mais j'aimerais tout de même comprendre pourquoi certaines amorces marche bien pour la PCR mais pas pour le séquençage. Peut être que le produit PCR amplifié n'est pas le bon mais bon peu de chance il migre comme même à la bonne taille attendus même si on peut amplifié autres choses à la même taille mais bon j'exclue cet idée à part celle la vous avez d'autres idées?
bon soit, allons y pour 3pM (ca fait quand même 1000x moins que pour les automates. Je pense qu'en mettre un petit peu plus ne nuirait pas à la qualité de ton séquencage bien au contraire).
Sinon ta PCR est intégrée dans un plasmide pour le séquencage ou tu séquences directement ton produit de PCR? Si elle est dans un plasmide tu peux essayer de séquencer avec Pu et RP (présent dans tous les plasmides classiques d'amplification type TA cloning tel que le pDrive de qiagen) ou avec T7 qui est aussi presque toujours présent. Je pense que ca vaudrait le coup de faire ce petit clonage.
Quant à savoir pourquoi tes oligos ne fonctionnent pas. Peut être que tes conditions d'hybridation de séquencages ne plaisent pas à tes oligos. Faudrait faire des essais, mais ca reste pas mal de boulot juste pour une séquence.
piwi
Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.
Ce matin je me suis posé une question quant à votre problème. Avez vous fait migrer un aliquote de vos oligos pour verifier qu'ils ne soient pas trop dégradés? Il est simplement possible que vous mettiez moins d'oligos que vous l'imaginez. Ca passe encore pour la PCR mais pour le séquencage où vous utilisez deja une concentration très basse, vous êtes peut être en dessous de la concentration limite.
Cordialement,
piwi
Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.
Oui effectivement j'ai pas pensé à faire migrer mes oligos sa peut être une possibilité.
Je séquence directement mon produit PCR. Je pourrais l'integrer dans un vecteur mais cela prendrais trop de temps car je n'ai pas seulment ce fragment (un exon) à sequencer mais j'ai 50 autres exons du coup je m'imagine vraiment pas faire 50 clonages. Par contre j'ai entendus dire que séquencer à partir de vecteur c'etaies beacoup plus jolies au niveau des séquences donc peut être que sa vaut le coup de le faire pour certains fragments.
J'essairais avec une concentration de 2µM comme même pour voir ce que sa donne en séquence
Tu peux me donner la séquence des oligos Pu et RP?
Je vais voir si dans mon labo ils ont un vecteur TA cloning. Je procederais ensuite: ligation standard, transfo/choc thermique, isolement sur boite pour sélectionnés les transformants et ensuite je crible les colonies qui ont l'insert et au fait le pDrive de Qiagen il à sans doute le gène Lac Z ?
oui le pDrive porte le lacz. De toutes manières tous ces plasmides sont dérivés d'un pUC donc ils portent tous le lacz.
Pour la ligation il n'y a rien de plus simple vu qu'il est vendu linéarisé avec le mix de ligation. T'as qu'a mettre ta PCR et ton plasmide ensemble, attendre un peu et étaler ça sur une boite ampi et basta. Le lendemain tu peux screener tes clones.
Je te donne le lien vers le handbook du pDrive.
http://www1.qiagen.com/literature/ha...spx?id=1000225
Note bien qu'il existe d'autres boites qui produisent des plasmides équivalents moins cher. Donc je te donne celui ci pour que tu vois ce que c'est mais vois en fonction de ce que tu as comme contacts avec les fournisseurs. Tu verras que page 9 il y a la séquence de la cassette de clonage avec PR (M13 reverse) et PU (M13 -20 et M13 - 40; tu peux choisir celui que tu veux.) Remarque que tu auras aussi les séquences du T7 et du SP6 (tu peux aussi ajouter T3 dans ta panoplie de primer de séquencage, on le trouve dans quelques plasmides.)
Au début du message je signalais que ces plasmides de TA cloning dérivaient du pUC. Ils sont optimisés pour améliorer le rendement du clonage des fragments de PCR. Du coup en ouvrant un pUC tout bête avec une enzyme de réstriction qui génère un fragment à extrémités franches tu devrais pouvoir cloner tes PCR mais le rendement ne sera peut être pas très bon.
Voilà. A mon avis si tu as des soucis de séquencage pour certains fragment ca peut être une manière d'avancer. C'est sur que si tu as plein plein de séquence ca peut devenir pénible.
Bon courage!
piwi
Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.
Juste quelques remarques
Les clonages bouts francs dans le pUC marchent tres bien a condition de ne pas utiliser smaI mais plutot Ecl136II qui coupe tres bien. Comme en plus on a le crible blanc/bleu c'est tout simple.Envoyé par piwi
je suis d'accord avec Piwi, cloner le fragment a sequencer permet souvent de simplifier le séquençage. Maintenant je ne crois pas trop a la degradation du primer pour expliquer ton absence de sequence. en effet un primer degradé donne surtout un mélange de séquence, ce qui fait qu'il y a du signal mais c'est totalement illisible.
Je pense que ton probleme viens plutot de la trop faible quantité d'oligos que tu utilises. Tu devrais augmenter ta quantité au moins a 20pmol pour voir ce que ca donne. en plus c'est bcp plus simple a essayer que de vérifier l'integrité de ton oligo.
Tout est une question de seuil en fait, j'imagine que pour certain primer ca marche un peu, mais que tu n'as jamais des signaux brutes tres forts, donc ca marchouille mais tu arrives a lire tes sequences. Maintenant quand tu es a ce genre de limite, alors une baisse d'efficacité meme de 20% entrainera que tes signaux passeront en dessous du seuil de detection et se confondrons avec le bruit de fond.
YOyo
Plutot que "pas très bon" j'aurais du écrire "pas aussi bon" c'est tout à fait exact. Merci de cette précision.
piwi
Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.
alalalalal excusez-moi j'ai écris trop vite et j'avais pas vue !!!
Je rectifie: la concentration de mes primers est de 3.2pmole/µl et non pas de 3.2pmole/l
Merci pour ta réponse PiWi je tenterais de faire le clonage si le pDrive n'est pas trop chére
J'ai acheté le pDrive de Qiagen (10 réactions), je vais voir ce que sa va donner.
Une extension final de 10 min à 72°C est vraiment nécessaire ?? car mes PCR sont deja faites mais avec une extension final de 5 min à 72°C. Aussi, le sreening est vraiment necessaire ou vraiment peu de chance d'avoir des non recombinant?
Avez-vous déjà essayé de recuperer le vecteur pour éviter encore une fois d' acheter le kit !!
le problème ca n'est pas de récupérer le vecteur c'est qu'il est fourni déjà linéarisé avec les extrémités prêtes à recevoir ta PCR et avec le milieu de ligation.
Le vecteur circulaire seul ne vaut sans doute pas mieux qu'un pUC que tu peux trouver partout.
Ensuite pour le protocole à suivre c'est vraiment tout bête. Nous classiquement pour une PCR qui a bien fonctionné on met 1µl de pDrive avec 1 µl de PCR (entre 500 et 1000 pb) et on laisse se faire la ligation à 4°C. Le protocole conseille 30 minutes mais tu peux laisser une nuit entière si tu veux être certain de tout avoir ligué. Dans ton cas ca n'est peut être pas utile.
Il n'y a rien de plus à faire, ca fonctionne tout seul.
Pour ce qui est de la probabilité d'avoir des non-recombinants elle n'est pas négligeable et le blanc bleu facilite un peu la tâche même si l'on peut s'en passer en sceenant par PCR (je n'ai jamais eu le cas de 25-40 colonies screener sans observer au moins plusieurs clones positifs)
pour l'extension finale je pense que 5 minutes suffisent amplement.
piwi
Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.
(je n'ai jamais eu le cas de 25-40 colonies screener sans observer au moins plusieurs clones positifs)
Sur 25 à 40 colonies qu'est ce que vous appellé plusieurs clones + ? 1, 10, 20?
au dela de 4 PCR de screnning, je trouve que sa commence à coûter assez cheres
Ca dépend un peu des clonages mais disons que ca va de 100% à 10% selon les PCR.
Tu as intéret si tu veux optimiser tes chances de cloner (c'est valable pour tout clonage et pas seulement le pDrive) à purifier tes fragments de PCR avant de procéder à la ligation.
Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.
Je pense faire la manips en fin d'année voir au début de l'année prochaine. Je te tiendrais au courant des résultats de mon séquençage!!
En tous cas merci bien pour cette idée
alalalalal!!! J'ai reçu le kit avant hier et j'etais pas la !! et on a stocké mes bactéries compétentes à -20°C au lieu de -80°C sa fait maintenant 2 jours qu'elle sont à -20°C!!!!
je suis enervée. Pensez-vous qu'elle ont perdus toutes leurs compétences en 48h à -20°C???
