[bio mol] hélicase

[inviteea96b0bf]

Au cours du semestre notre prof nous a posé la question suivante:
On étudie la réplication:Quelle experience enzymatique réaliser pour déterminer le rôle des hélicases ?

devant l'absence total de réponse de l'amphi elle nous a promis que cette question serait à l'exam (qui approche à grand pas ... )

je pensai mettre en presence tout les composant de la réplication (classique de E. Coli ..on vas pas compliquer ...) ADN, dNTP(marqué pour réperer une éventuel réplication), primase, ADN poly, ligase, SSB ...

sauf hélicae et voir le résultat (pas de réplication) . mais je pense que je suis beaucoup trop simpliste car on ne mettrai en évidence par cette methode que le rôle majeur des hélicases dans la réplication ...

du coup je fait appel a vous pour m'aiguiller !!
SVP
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[invite2be96323]

Il me semble que si on fait ce que tu proposes, on montre simplement que l'hélicase est indispensable à la réplication mais non son rôle.

[inviteea96b0bf]

oui c'est exact! et c'est bien mon problème !

[invitea0443c8c]

Salut!
Voyons voyons....
L'hélicase permet de dérouler l'ADN... Donc ce qu'il faut trouver c'est un signe visible lorsque l'ADN est déroulé, et ensuite tu enlèves l'hélicase pour montrer que lorsque l'hélicase n'est pas là l'ADN n'est pas déroulé.... Ou je sais ça parait bête mais au fond la question c'est de trouver un moyen de repérer l'ADN déroulé....
Une fois que tu as montré ça, le rôle de l'hélicase est évident car si l'ADN n'est pas déroulé il ne peut pas être répliqué...

EDIT: j'ai une petite idée mais je vais te laisser chercher un peu....

Vinc

[A voir en vidéo sur Futura]

[inviteea96b0bf]

oui j'avais aussi ce raisonement .. mais comme je ne voyais pas je n'ai pas approfondi . je vais chercher et comme on dit la nuit porte conseil !!

[invitea0443c8c]

Ok je te laisse la nuit alors , mais rien ne dit que ma (soit disante) solution soit bonne! J'ai, en général, des hypothèses un peu tordues..... Mais bon on va voir...

A+
Vinc

[invite40216b76]

Et si tout simplement on mettait un ADN double brin avec tout ce qu'il faut pour la réplication sauf l'hélicase, résultat, ça marche pas.
Puis dans une autre expérience un ADN double brin mais avec une extrémité non appariée, celle 5' de l'un et 3' de l'autre (on mime le travail de l'hélicase). On met l'ADN avec tout ce qu'il faut pour la réplication, et là, ça marche.

Conclusion, l'hélicase sépare l'ADN double brin.

[inviteea96b0bf]

peux tu m'éxpliquer plus en détail ..je ne suis pas sur de comprendre.

moi je pensais sinon fabriquer un ADN double brin linéaire. contenant non loint de l'origine de replication un site de reconnaissance d'une enzyme de restriction.

Pour le témoin: On met cette enzyme en contact. (logiquement on aura apres éléctrophorèse)
l'experience consiste a mettre l'hélicase et l'enzyme de restriction et on ne devrait plus avoir qu'une bande (car l'enzyme ne peut pas coupé de facon simple brin)


Mais rien ne dit que l'hélicase agira avant l'enzyme de restriction .mais a la rigeur ce ne serrai pas tres grave, on aurait trois bande dans ce

[invitec9f0f895]

La manip est toute simple:

Tu synthetises un fragment double brin d'ADN marqué radioactivement. Tu fait agir ton helicase (qui probablement n'a pas besoin des autres protéines du complexe de replication pour agir) et tu deposes le produit de la reaction sur un gel de polyacrylamide. tu devrais voir tes fragments simples brin et ton fragment double brin et ainsi evaluer l'efficacité de ton enzyme

Yoyo

[inviteea96b0bf]

mais oui tu as raison !
c'était simple pourtant ! je suis vraiment trop con ....
par contre faut que je verifie que l'hélicase n'as pas besoin d'autre truc . Il me semble q'elle ce fixe apres fixation de DNA A ce qui permet au complexe helicase DNA C d'approcher puis DNA C "s'en vas " et l'hélicase commence son rôle ... mais le poursuit elle quand il n'y a rien d'autre...


PS: il y a un autre problème comment empecher des lors les brins d'ADN complémentaire de se réapparier ? normalement c'est SSB qui le fait ...mais si je fixe SSB, ca modifie la migration sur mon gèle pour les simple brin ...