Resolubilisation des proteines aprés extraction au trizol

[invite45020705]

Bonjour,
Je suis en stage pour le M1. On travaille sur l'hypophyse de rat et on a fait une technique d'extractin d'ARN et de proteines au trizol. Ensuite les proteines sont mises dans du SDS et stockés à moins 20°C. Sauf que quand on a fait un dosage proteique par la methode de lowry d'où on a obtenu des quantités trés faibles de proteine; pourtant on a soniqué avant. En fait c'est dû à u problème de resolubilisation des protèines ( il reste tjrs un petit culot au fond du tube aprés sonification).
Quelqu'un peut-l m'aider à trouver une solution pour ça?
Merci
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[Flyingbike]

$récupérer les protéines apres extraction aux solvants organiques n'est pas le mieux. Je sais que l'hypophyse n'est pas énorme, mais l'idéal est d'extraire les ARN et protéines séparément.

[invite45020705]

En fait on l'a deja fait sur l'ensemble des echantillons. Il ne reste qu'à faire les dosages. Vous n'avez pas une autre solution?

[Flyingbike]

vous avez récupéré quelle phase pour les protéines ?

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite45020705]

En fait on a ajouté à l'echantillon d'hypophyse 800 µl de Trizol. Aprés homogeinisation , on a incubé pendant 5mn . Ajout de chloroforme (incubation 3mn) et centrifugation à 12 000 tours pendant 15mn à 4°C . On a obtenu une phase aqueuse transparente contenant L'ARN et une phase rouge contenant l'ADN et les proteines.

[invite45020705]

Après avoir récupéré la phase rouge contenant l’ADN et les protéines, on a ajouté 300µl d’éthanol 100% pour précipiter l’ADN. Après incubation 3mn, on centrifuge à 4600 tours pendant 5 mn. On prélève la phase aqueuse à laquelle on ajoute 1ml d’isopropanol pour précipiter les protéines

[invite513ac0a6]

Un autre problème peut être que le SDS induit quelques soucis dans les dosages de protéines par la méthode Lowry. Dans certains kits tu as un produit supplémentaire à inclure dans ta réaction si tes échantillons contiennent du SDS, je saurais pas t'en dire plus vu que j'ai toujours utilisé ce genre de kit en suivant bêtement le protocole fourni.

[invite45020705]

Merci pour votre réponse!
En fait on utilise pour la methode de lowry le kit DC proteine essay de BIO RAD qui comprend 3 reactifs. L'echantillon n'est pas homogène même aprés sonification.

[invite2e21fee6]

C'est l'éternel problème des protéines, une fois précipitées elles peuvent le rester...Il existe certaines solution qui impliquent de dénaturer les protéines (urée 8M ou chlorure de guanidium 6M) pour les solubiliser. Plus rare mais parfois très efficace solubiliser dans de l'arginine 1 ou 2 M, ça peut donner des bons résultats.

Dans tous les cas il faudra envisager un traitement drastique (à mon avisà