Problème Extraction ARN totaux méthode Trizol-Chloroforme

[invite635f5095]

Bonjour à tous,

Je viens de terminer pour la 6ème fois mon extraction d'ARN totaux à partir de cerveaux de souris par la méthode du Trizol puis Chloroforme et j'ai toujours le même problème. Au final, j'ai une très faible concentration d'ARN (de l'ordre de 200ng/µL)

J'explique en quelques lignes ma méthode : Une fois avoir prélevé le cerveau, je le coupe en 6 parties que je mets chacune dans un tube. J'y ajoute 1 mL de Trizol, je broie le tout au polytron (3x10secondes). Une fois broyé, je centrifuge le tout pendant 15min. Je récupère le surnageant puis j'ajoute 500µL de chloroforme, je recentrifuge le tout 10 min. Je récupère la phase aqueuse puis après je fais les étapes avec l'isopropopanol puis éthanol...

J'ai changé le trizol, le chloroforme et toujours pareil...

Quelqu'un peut-il m'aider ???

Merci d'avance
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[Flyingbike]

200ng/µL, c'est une concentration qui peut être normale, ça n'est pas aberrant. En surnageant, tu récupères combien ? j'imagine que ça tourne autour des 500µL. Par contre, l'ajout de chloroforme se fait avant toute centrifugation puisqu'il participe à la formation des différentes phases !


Pour un tissu broyé dans 1 mL de trisol je te conseille ça :

-s'assurer que le tissu est bien homogénéisé (utiliser une seringue avec aiguille de 23g, aspirer et refouler plusieurs fois peut aider)
-ajouter 250µL de chloroforme par tube de 1mL de trizol + tissu
-vortexer 30'' (pas moins, c'est l'étape la plus importante, celle ou tu récuperes les acides nucléiques dans la phase aqueuse, et le reste dans la phase organique)
-laisser 10 minutes sur glace
-centrifuger 15 min au max
-récupérer surnageant (ne pas prélever d'autre phases)(autour de 400 ou 500µL)
-ajouter un volume d'isopropanol, bien agiter par retournement, laisser 10' sur glace
-centri 20' au max
-jeter le surnageant
-rincer le culot dans un grand volume d'EtOH 70 (genre 1mL)
-sécher
-reprendre dans H2O

Essaie deja ça, ça devrait aller mieux.

SInon une autre piste : le cerveau est plein de lipides, il faut peut être changer le ratio trisoc chloroforme:quantité de tissu !

[invite2d571b60]

Salut,

Dans le labo où je suis, on utilise un kit commercial qui fonctionne pas trop mal : le kit "absolutely RNA miniprep kit" de Stratagene.

Bonne chance

[invite635f5095]

Oui environ si ce n'est plus. Ben c'est infime la concentration. Car avec le kit j'ai vu que ça avoisinait les 5µg

[A voir en vidéo sur Futura]

[Flyingbike]

ca doit être le rendement total. je te jure que 200ng/µL c'est deja suffisant pour pas mal d'applications. Sur du foie j'ai entre 400 et 1000, j'ai une collègue qui fait ça sur du cerveau je lui demanderai.

Tu fais quoi de tes ARN ensuite ?

[invite635f5095]

Des puces et j'ai besoin de 10µg

[invite635f5095]

200ng/µL, c'est une concentration qui peut être normale, ça n'est pas aberrant. En surnageant, tu récupères combien ? j'imagine que ça tourne autour des 500µL. Par contre, l'ajout de chloroforme se fait avant toute centrifugation puisqu'il participe à la formation des différentes phases !


Pour un tissu broyé dans 1 mL de trisol je te conseille ça :

-s'assurer que le tissu est bien homogénéisé (utiliser une seringue avec aiguille de 23g, aspirer et refouler plusieurs fois peut aider)
-ajouter 250µL de chloroforme par tube de 1mL de trizol + tissu
-vortexer 30'' (pas moins, c'est l'étape la plus importante, celle ou tu récuperes les acides nucléiques dans la phase aqueuse, et le reste dans la phase organique)
-laisser 10 minutes sur glace
-centrifuger 15 min au max
-récupérer surnageant (ne pas prélever d'autre phases)(autour de 400 ou 500µL)
-ajouter un volume d'isopropanol, bien agiter par retournement, laisser 10' sur glace
-centri 20' au max
-jeter le surnageant
-rincer le culot dans un grand volume d'EtOH 70 (genre 1mL)
-sécher
-reprendre dans H2O

Essaie deja ça, ça devrait aller mieux.

SInon une autre piste : le cerveau est plein de lipides, il faut peut être changer le ratio trisoc chloroforme:quantité de tissu !

Donc vous vous ne faites pas de centri intermédiaire pour éliminer les déchets après le broyage ?

[Flyingbike]

non, si tu ne mets pas trop de tissu, et si'l est bien homogénéisé, il n'y a pas besoin. Ma collègue a testé plusieurs quantités de chloroforme, et en mettre trop altère le rendement. Quelle est la taille du morceau que tu broies ? (ou la masse)

[invite635f5095]

1/4 ou 1/6e de cerveau de souris donc ça fait pas lourd

Donc d'après toi il faut broyer, puis ajouter chloroforme puis centri 30min

Tu mets quel volume de chloroforme?

[Flyingbike]

1/4 de cerveau de souris c'est deja trop à mon avis. Pour un mL de trizol je mettrais quelque chose de la taille d'une tete d'allumette. Sinon pour le chloroforme, je mets 250µL par mL de trizol.

[Flyingbike]

autre chose, tu resuspends ton culot dans quel volume d'eau ?

[invite635f5095]

ça représente à peu prés ça 1/6e. au final tu obtient des concentrations de combien ?

[invite635f5095]

autre chose, tu resuspends ton culot dans quel volume d'eau ?

je resuspend dans 40µL

[Flyingbike]

donc tu récupères genre 8µg. Moi je récupère 50µL a ~800ng/µL.

[invite635f5095]

Oui sauf qu'après la purif avec le kit je n'obtient plus grand chose

[Flyingbike]

alors je te fais une autre suggestion :

il y a chez qiagen un kit pour préparer pas mal d'ARN à la fois (RNeasy midi kit je crois, jusqu'à 1mg, mais peut être que le RNeasy mini te suffirait), que l'on peut associer à un tampon de lyse spécial pour les tissus riches en lipides comme le cerveau (qiazol lysis reagent). Ce tampon contient du phénol qui aide a la solubilisation du tissu.

Ensuite le kit fonctionne par liaison des ARN sur une colonne, au final la pureté convient à tout type d'application (donc pas besoin de purif supplémentaire)

[invite635f5095]

Je viens de le commander. Je testerai la semaine prochaine