extraction phénol chloroforme

[kraptak]

Bonjour, j'aimerais savoir quels sont les avantages et/ou incovénients d'une telle extraction par rapport à une miniprep. Merci!
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[Yoyo]

salut

quesque tu appeles une miniprep? car le protocole de miniprep (autre que par colone) inclu une etape de phenol chloroforme, qui permet de denaturer les proteines et donc de debarasser l'ADN des proteines.


Yoyo

[lipstyka]

autre inconvénient de phé/chloro : la toxicité et le temps de la manip, voire éventuellement la qualité de purif. Les minipreps en kit sont une avancée technologique; elles ont de ce fait beaucoup plus d'avantages que les "anciennes" méthodes.

[wishangel]

Je rejoins cette avis. Il est clair que les kit sont un gain de temps non négligeable. Après, tout dépend de l'utilisation qu'on veut faire de son ADN. En terme de rendement rien ne vaut la méthode a l'ancienne...

[peptofr]

Bonjour,
En fonction de la "categorie" ou de la "qualité" du kit l'ADN sera plus ou moins propre.
L'extraction phenol/chloroforme (ou "old school") ne permet pas à elle seule de faire une extraction d'ADN. Il faut faire une lyse des cellules (lyse alcaline ou pk ou ...) et d'autres étapes d'extraction/purification/précipitation/lavages peuvent être ajoutées. L'extraction phénol ne permet que de "laver" ton ADN préparé en le débarassant des protéines (jusqu'à un certain point)... reste plus qu'a faire une extraction chloroforme pour enlever le phenol qui est dissout dans la phase acqueuse.

Les kits sont honéreux, rapide, facile d'utilisation, fiables, ne donnent pas forcement un rapport 260 280 exeptionnel, les rendements ne sont pas fantastiques, dans le cas de la purif de plasmides, certains kit peuvent avoir une préference pour purifier du supercoiled DNA qui peut être plus difficile à digérer.
Les méthodes manuelles prennent du temps, on généralement un bon rendement, la qualité est celle que l'on souhaite en fonction des étapes que l'on met en oeuvre, entierement configurables, peu honéreuses, la fiabilité et l'efficacité peuvent dépendre de l'expérimentateur (feeling)...

Dernier point de comparaison, qui n'engage que moi, quand on fait un protocole "manuel", généralement, on sait ce qu'on fait, pourquoi, on reflechit un peu et une erreur peut etre rattrapable. Pour les kits, le protocole consite souvent à faire passer des sauces A B ou C sur une colonne/filtre, cela est (parait) facile et on a vite fait d'intervertir 2 sauces ou de jeter l'ADN...

Voilà pour mon avis sur la question Le choix dépend des moyens à mettre en oeuvre (temps/argent) et du résultat souhaité.

[A voir en vidéo sur Futura]

[Yoyo]

salut

juste un point de detail, mais l'ADN supercoiled est plus facilement coupable que l'ADN qui ne l'est pas. L'enroulement negatif de la molecule favorise son ouverture et donc son accessibilité aux enzymes.

Personnellement pour mes minipreps j'utilise le kit wizard+ qui marche tres bien et me donne un ADN de qualité sufisante pour faire du sequençage automatique derriere. Le prix est d'environ 1euro par miniprep ce qui n'est pas si cher que ca.

Yoyo

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[piwi]

Pour mes sequencages je n'utilise pas de kit et je procède "à la main" avec les solutions que nous faisons nous même.
Le kit apporte-t-il vraiment un plus?

Cordialement,
piwi