protocole

[invite75423e77]

svp aidez moi j'ai besoin de vos conseils:

voila j'ai un protocole à faire dans lequel on doit metre en évidence la différeciation des fibroblastes 3T3 en adipocytes. Pour cela j'ai pensé utiliser du red oil,
mais voila, le prof va nous donner des cultures cellulaires adhérentes dans des boites. alors on va d'abord ajouter une dose d'insuline pour induire la diférenciation et on démontrera cela avec le red oil mais coment l'utiliser?? est ce qu'on va apliquer le red oil directement dans la culture cellulaire avec son milieu de culture ?? est ce que c'est possible de mettre les cellules en suspension et faire l'aplication du red oil ?? est ce qu'on applique le red oil directement ou il faut plusieurs étapes ??
aidez moi svp!!!!!
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[invite77749503]

Oil Red, permettra de voir la présence du tissu adipeux, en effet c'est un marquage des adipocytes,
Le marquage n'est pas possible sur les cellules en suspension, il faut enlever le milieu, fixer les cellules et puis incuber avec Oil Red
Ce type de marquage on peut faire sur les tissus aussi, qui sont inclu en parrafine ou cryo.




voir le lien, le protocole en détail,

[invite77749503]

http://www.ehow.com/how_8727361_use-...entiation.html

[invite77749503]

J'ai oublié de noter,

on induit d'abord la différenciation, on incube les cellules et puis, on fixe les cellules et et après on fait le marquage sur les cellules

[A voir en vidéo sur Futura]

[Flyingbike]

Alors quelques petites corrections :

le Oil-Red-O n'est pas un colorant des adipocytes, et ne l'a jamais été. C'est un colorant des lipides neutres. Certes il colore un adipocyte parce que c'en est plein, mais ce n'est pas spécifique du type cellulaire. Le marquage sur coupe parraffine est très mauvais simplement parce que le xylene ou équivalent utilisé pour l'inclusion et la réhydratation dissout les lipides.

Enfin, dans le protocole donné, on dit de "mettre de l'oil red o sur les cellules", seulement on ne connait en rien comment la solution a été préparée. L'Oil red O est un solide, il faut donc à un moment préparer une solution. J'ai un super protocole mais qui utilise du tryethylphosphate, un truc qui n'est pas courant dans un labo de bio. Il est facile de trouver un protocole à base d'une solution aqueuse+isopropanol (moins joli mais fonctionne).

Dernier point, c'est mon jugement personnel, une cellule colorée a l'oil red o n'est pas forcément un adipocyte. Pour ma part je juge irrecevable, comme preuve, un marquage de la sorte, d'autant que la coloration n'apporte pas énormément d'informations par rapport à la simple observation morphologique de la cellule. Il y a d'autres cellules qui peuvent accumuler du lipide sans que ce soient des adipocytes (par exemple des hépatocytes). Après, d'après ce que j'ai compris il s'agit d'un TP et je ne sais pas quels sont les moyens disponibles, mais on peut également s'intéresser a l'expression de marqueurs spécifiques précoces (PPARgamma, C/EPBalpha, etc...) ou plus tardifs (leptine, perilipine, PEPCK, etc...).