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protocole d'extraction d'ADN




  1. #1
    Ali.Z

    Exclamation protocole d'extraction d'ADN

    bonjour,

    je travail sur l'extraction de l'ADN à partir des bactéries (LES STREPROMYCES), je cherche des protocoles d'extraction d'adn pour les bacteries mais je n'trouve que mes noms mais pas de protocole s'il yas quelqu'un qui peut m'aider

    Merci

    -----


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  3. #2
    Flyingbike

    Re : protocole d'extraction d'ADN

    BOnjour

    Pour vous aider, il faudra connaitre la finalité de cette extraction : clonage, séquencage, etc ...?

  4. #3
    Ali.Z

    Re : protocole d'extraction d'ADN

    pour but la PCR,
    mais avant tous il faut que je met les streptomyces ont culture (j'ai trouvé le milieu MRS-AGAR mais j'ai po trouvé le contenu de se milieu) et faire une extraction d'ADN pour a la fin faire la PCR


    Grand Merci Flyingbike


  5. #4
    Ali.Z

    Re : protocole d'extraction d'ADN

    Tjrs pas de réponse a ma question :s

  6. #5
    Flyingbike

    Re : protocole d'extraction d'ADN

    Bonjour

    ce protocole a l'air correct : http://www.protocol-online.org/cgi-b...he.cgi?ID=2051

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    Ali.Z

    Re : protocole d'extraction d'ADN

    Bonjour,

    oui ce protocole est correcte mais il est general or mon objet c d'extraire ADN chez les streptomyces c un peu pas comme les autre si tu vois ce que je vx dire

    Merci Flyingbike

  9. #7
    marinesvt

    Re : protocole d'extraction d'ADN

    Bonjour,
    Avec les mots clefs "DNA extraction streptomyces" sur google, on trouve des publications sur le sujet. je ne sais pas si vous les avez vues.
    J'espère que ça vous aidera.

    Marine

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  11. #8
    Ali.Z

    Re : protocole d'extraction d'ADN

    Bonjour,

    oui j'ai essayé mais ce que je trouve c des these de doctorat et la partie qui m'interesse il parle brievement de l'extraction d'ADN "on a utulisé pour l'extraction la methode X ... " et quand je cherche la methode je n'y trouve rien , je vais ressayer encore une fois si je tombe sur quelque chose.

    MErci Marine

  12. #9
    Flyingbike

    Re : protocole d'extraction d'ADN


  13. #10
    Ali.Z

    Re : protocole d'extraction d'ADN

    oui j'ai vu mais je n'vois pas les étapes du protocole

  14. #11
    Flyingbike

    Re : protocole d'extraction d'ADN

    pourtant tout y est détaillé

  15. #12
    Ali.Z

    Re : protocole d'extraction d'ADN

    ahh bon je v traduire (je suis nul en anglais je crois que la bonne partie je les zappé )
    la mon encadrant me demande de lui chercher tous les méthodes d'extraction d'ADN pour les Actinomycetes vu les streptomyces et leur problèmes
    ohhh mon dieu

  16. #13
    Ali.Z

    Re : protocole d'extraction d'ADN

    http://openwetware.org/wiki/Streptom...Mini-Maxi_Prep
    j'ai trouver cette méthode jetez un coup d’œil s'il vous plait !!

  17. #14
    marinesvt

    Re : protocole d'extraction d'ADN

    Bonjour,
    Avant de se disperser sur des protocoles, il faut être sûr d'avoir bien compris ce que vous voulez faire.

    Extraire de l'ADN génomique ou plasmidique ?

    Ce n'est pas la même chose et cela peut même être incompatible :
    -La préparation d'ADN plasmidique passe par une étape d'élimination de l'ADN génomique.
    je cite wikipédia : http://fr.wikipedia.org/wiki/Extraction_d%27ADN
    «À ce pH très alcalin, l'ADN est dénaturé, c’est-à-dire que les deux brins de la double-hélice sont séparés. On neutralise ensuite rapidement la solution, ce qui provoque la renaturation brutale (réappariement des brins du duplex d'ADN). L'ADN chromosomique, très long (~10⁶ paires de base), ne parvient pas à se réapparier complètement et forme des enchevètrements insolubles. L'ADN plasmidique, court (~10³ paires de base), parvient à se reformer et reste en solution. On sépare alors les espèces par centrifugation. Les protéines précipitées, sont également éliminées avec le détergent et l'ADN chromosomique.»

    Tout ce qui s'appelle miniprep midiprep ou maxiprep correspond à une extraction d'ADN plasmidique. Le lien que vous proposez est une méthode de miniprep. Il ne vous intéresse donc pas si vous cherchez à purifier l'ADN génomique.

    Pourquoi les méthodes «traditionnelles*» fonctionnent mois dans le cas des Streptomyces ?
    La bactérie la plus utilisée en clonage est E. coli. C'est une bactérie gram-. Si vous cherchez un protocole d'extraction d'ADN, la plupart que vous trouverez concerneront cette bactérie.
    Les bactéries de type gram – possèdent moins de peptidoglycanes que les bactéries gram + (voir schéma). scan_0040.jpgL'étape de lyse de la paroi cellulaire ne fonctionne donc pas aussi bien quand on utilise une méthode «*traditionnelle*» sur des bactéries gram+.
    je cite l'article disponible en suivant ce lien : http://www.biotechniques.com/multime...m05_10134a.pdf
    «Streptomyces are Gram-positive bacteria, making DNA isolation difficult due to their resistance to cell lysis (6,7). Most methods use lysozyme and sodium docecyl sulfate (SDS) for cell disruption. To further increase lysis, glycine is often incorporated into media to minimize peptidoglycan cross-linking; muramidases such as mutanolysin or grinding of mycelia are also commonly used»

    Comment trouver des protocoles d'extraction ?
    Faire de la bibliographie n'est pas toujours facile. Moi je procéderais ainsi :
    -identifier le but précis de votre protocole (extraction d'ADN génomique ou plasmidique)
    -trouver une ou plusieurs publications en faisant une recherche sur un moteur de recherche spécialisé ou non (google, google schoolar, pubmed …). par exemple, les liens donnés dans cette discussion.
    -cela fait déjà un protocole
    -les auteurs font souvent référence à d'autres publications dans lesquelles il est possible de trouver à nouveau un protocole.
    -chercher les articles qui cite l’article étudié ("related citation" sur pubmed par exemple). Peut-être que d'autres auteurs ont en effet améliorer la méthode.

    La bibliographie est en anglais (et oui !). Vous pouvez peut-être essayer de chercher des sites ou des dictionnaires spécialisés dans l'anglais scientifique.
    il faut aussi essayer de bien noté les publications que vous avez exploré (sinon, vous risquez de tourner en rond). Tout comme vous tenez un "cahier de laboratoire", faites de même pour la biblio. Cela m'est arrivé de ne pas le faire et de mettre des heures à retrouver une publi intéressante

    J'espère que ces conseils vous auront aidé et vous souhaite bon courage !

    Marine

  18. #15
    Ali.Z

    Re : protocole d'extraction d'ADN

    Bonjour,

    tous d'abord un Grand Grand merci Marine votre réponse ma énormément aider et elle ma donner espoirs
    oui vous avez raison sur toute la ligne mon but c faire les 2 extraction d'ADN plasmidique et genomique a partir des streptomyces
    le prof me demande de lui trouver tous les methode d'extraction possible leur ingrédient et les problèmes qu'on peut rencontré lors de la manipulation
    pour l'anglais je fais avec les sites de traduction,j'en demande a des collègues sans oublier mon petit dictionnaire

    encore une fois merci Marine a l'attente de votre aide si précieuse

  19. #16
    Ali.Z

    Re : protocole d'extraction d'ADN

    Bonjour,

    enfin j'ai eu un protocole de mon prof mais je trouve trop de difficulté a le comprendre si vous pouvez m'aider;voila le protocole :

    Mycelium (surface of a 10day-old colony)pn yeast extract malt extract agar

    1) 2 loopfuls

    2) +400µl saline-EDTA extraction buffer

    3) incubation at 37°C

    4) +1%(w/v) protainase K in the presence of 25%(w/v) SDS

    5) incubation

    6) phenol-chloroform extraction

    7)ethanol precipitation step

    (a final purification step was carried out with purificationkit,BioRad...)

    Saline-EDTA extraction buffer: 0,1M NaCl ; 0,1M EDTA,pH8 + lysozyme(10mg/ml)


    voila la protocole que mon prof ma demande de faire avec mais le problème c que je ne trouve pas tous les donnée il faut que je le complète mais je ne sais pas comment vu que c la 1er fois que je fait une extraction d'ADN pour une bactérie et aussi le prof ne m'as pas donner la source de ce protocole :s
    SDS a 25% j'ai jamais vu tous les protocole que j'ai vu son a 10% SDS
    SVP si vous pouvez m'aider on me complétant ce protocole avec le temps d'incubation et les calcules a faire pour le SDS la protainase K phenole ...

  20. #17
    Ali.Z

    Re : protocole d'extraction d'ADN

    tjrs pas de réponse les amis

  21. #18
    noir_ecaille

    Re : protocole d'extraction d'ADN

    Entre le 5) et le 6) il ne devrait pas y avoir une centrifugation ?
    "Deviens ce que tu es", Friedrich W. Nietzsche

  22. #19
    Ali.Z

    Re : protocole d'extraction d'ADN

    Bonjour,

    je n'sais pas trop mais j'ai trouvé commeça le protocole j'ai rien ajouter ni éliminer :s

    Merci pour ta reponce

  23. #20
    noir_ecaille

    Re : protocole d'extraction d'ADN

    Parmi les liens suora, vous avez (en anglais) ceci : http://www.biotechniques.com/multime...m05_10134a.pdf

    A priori ce me semble pile poil ce qu'il faut.
    "Deviens ce que tu es", Friedrich W. Nietzsche

  24. #21
    Ali.Z

    Re : protocole d'extraction d'ADN

    oui mais ce protocole avec le poid sec or moi j'aimerai faire une extraction liquide vous me comprenez !!

  25. #22
    noir_ecaille

    Re : protocole d'extraction d'ADN

    Ça ne change pas grand chose. Il vous suffit de centrifuger au préalable votre culture et d'utiliser le culot
    "Deviens ce que tu es", Friedrich W. Nietzsche

  26. #23
    Ali.Z

    Re : protocole d'extraction d'ADN

    emmm je vois donc je peux prendre les mêmes valeurs que dans ce protocole en anglais et les mettre pour mon protocole
    mais un truc a propos des % exemple moi j'ai 1% de proteinase K comment je peux savoir le % qu'il on fait dans le protocole ???

  27. #24
    noir_ecaille

    Re : protocole d'extraction d'ADN

    On a une quantité en mg. Il vous suffira de faire quelques calculs en fonction du poids moléculaire de la protéinase K pour retrouver la quantité via le volume nécessaire de solution à 1%
    "Deviens ce que tu es", Friedrich W. Nietzsche

  28. #25
    Ali.Z

    Re : protocole d'extraction d'ADN

    je vois je v faire les calcules et je vais vous l'envoyez me le corrigé
    ahh s'il vous plait noir_ ecaille pour le milieu ISP2 + saccharose je prépare le milieu et je l'autoclave après j'ajoute du saccharose ou bien je mélange le tous et j'autoclave (d’après mes connaissances il faut évité la réaction de melyer parce que e saccharose en autoclave rien ne reste)

  29. #26
    noir_ecaille

    Re : protocole d'extraction d'ADN

    Moi je le rajouterais le saccharose après autoclave. Autrement on peut craindre la formation de caramels je pense.
    "Deviens ce que tu es", Friedrich W. Nietzsche

  30. #27
    Ali.Z

    Re : protocole d'extraction d'ADN

    oui exactement et pour le saccharose préférable l'ajoute poudre ou bien solution
    si solution je l'autoclave ??

  31. #28
    noir_ecaille

    Re : protocole d'extraction d'ADN

    Difficile à dire. Du moment que c'est stérile -- mais pas en autoclave, on aurait des caramels.

    Si liquide et fait maison : stérilisation par tyndallisation, UV ou X. Bien faire gaffe à tenir compte du volume final pour ne pas se tromper sur le %age final de saccharose.

    Si solide : je sèche un peu. Dépend grandement de la stérilité de la source je pense. Peut-être tyndallisation du milieu au complet après ?
    "Deviens ce que tu es", Friedrich W. Nietzsche

  32. #29
    Ali.Z

    Re : protocole d'extraction d'ADN

    bonjour,

    voila j'ai mis milieu ISP2 seul a s'autoclavé et le saccharose a s'autoclavé (pour la solution du saccharose j'ai mis 20g/100ml et j'ai autoclavé)
    j'ai mis 25ml du milieu ISP2 + 2,5ml du saccharose et j'ai incubé ma preculture(ISP4 + ma bactérie que j'ai incubé il y'a 48h)
    les résultats c après 48h
    le saccharose n'a pas caramélisé 'heureusement pour moi
    Merci pour ton aide noir_ecaille

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