Problème lors d'extraction d'ADN

[invite40a15ab9]

Bonjour à tous !

J'ai un petit (voir gros ) souci à vous exposer : je suis en train de réaliser des extractions d'ADN à partir de rate et de thymus de souris à l'aide du kit QIAGEN mini kit DNA extraction.

Il y a avant l'extraction proprement dite une étape de lyse des tissus (on ajoute de la protéinase K et du tampon ATL de lyse et on laisse la lyse se faire de 1 à 3h00 à 56°C). Je l'ai fait hier et ça a très bien marché (il restait quelques morceaux de tissus et j'ai pu utiliser le liquide dans lequel baignaient ces morceaux).
J'ai fait exactement la même chose aujourd'hui et au lieu d'un liquide utilisable pour l'extraction d'ADN (qui se fait sur colonne), j'ai obtenu une sorte de gélatine uniforme inutilisable (alors que j'ai laissé la lyse se faire pendant 3h30 au moins).

Quelqu'un aurait-il déjà rencontré ce genre de problème ? Et mieux, quelqu'un aurait il une solution ou une proposition ?
Pour le moment j'ai rajouté de la proteinase K et du Lysis Buffer, et je vais laisser la lyse se faire toute la nuit... On verra bien demain

Merci d'avance pour votre aide

Ju.
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[invitec9f0f895]

Salut

tu as essayé de rajouter de la RNAse A?
Yoyo

[invite40a15ab9]

Non j'ai pas essayé ça vu que ça avait marché tel quel la première fois... Qu'est ce que ça pourrait changer ?

[invite71f23525]

La RNase A permet de se débarrasser des ARNs, en les rendant solubles, ce qui évite de former des agrégats insolubles. Normalement dans les tampons de resuspension des kit de préparation d' ADN, il y a de la RNase A, permettant ainsi d'avoir un lysat plus homogène. Le problème peut donc venir de là.

Greg

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite40a15ab9]

Ok merci pour la réponse ! (désolée de re-poster si tard mais j'ai eu pas mal de boulot entre temps...)

Je suis venue à bout de l'immonde amas visqueux en le liquéfiant avec une seringue ! (comme on n'avait pas de RNase A en stock ^^)
Je tenterais le coup la prochaine fois

Merci encore

Ju.

[piwi]

En général on lyse toute la nuit. 3h me semblent peu.

[invite40a15ab9]

Bonjour,

Le kit indiquait 3h00 minimum. Mais vu que ça donnait de la gelée, on a laissé la lyse se poursuivre toute la nuit mais ça n'avait rien changé.

Le plus étrange c'est que ça ne s'est produit qu'une seule fois, je n'ai plus rencontré ce problème par la suite... Si ça se trouve j'ai fait une erreur de pipetage, bien que je sois plutôt sûre de moi... Enfin bref !

Merci de vos précieux conseils et bravo pour ce forum très instructif !

A bientôt

Ju.