Problème avec un protocole d'extraction de collagène I

[invite07f30d6a]

salut a tous

voila pour mon stage, je doit isoler du collagene I de queues de rats, 3 fois que je recommence, y a toujours une couille dans mon potage. si quelqu'un y voit une erreur qu'il me le signal, parceque la je craque un peu.

le protocole en question:
-4 queues de rat lavées et passées à l'ethanol
-dissection pour extraire les tendons (premier pb: meme si je travail sur champ steril avec du materiel steril, la piece elle ne l'est pas...)
-les tendons (4x4 faisceaux) sont placés dans 200ml de NaCl 1%
-lavés 2 fois avec 200ml NaCl 1%
-lavés à l'eau distillée (200ml) 2 fois
-placés dans 1l d'acide acétique 3% à 4°C pour la nuit à très faible agitation
-la mixture obtenue est filtrée sur gaz stérile
-centrifugation à 10 000g pour 2h à 4°C
-le surnageant est récupéré
-y est ajouté au goute à goute 1/5 du volume en NaCl 30% à 4°C sous légère agitation (le tout est préparé sous la hote avant d'être tranféré dans la chambre froide)
-centrifugation à 3300g, 30min à 4°C
-les culots sont ressuspendus dans une solution 5% NaCl et 0,6% acide acétique, à raison d'un volume pour 2 culots (là, question: un coup on me dit de ressuspendre à la pipette très gentillement, un autre coup on me dit de faire ça au bareau magnétique toujours très gentillement quitte à laisser le tout une nuit à 4°C... je fait quoi moi?)
-recentrifugation à 3300g, 10 min à 4°C
-ressuspendre tous les culots dans 250ml de la solution 5% NaCl/ 0,6% acide acétique (là encore même question que précédement: pipette ou bareau magnétique?)
-la solution passe en dialyse contre 4l d'acide chloridrique pH=3 (~1mM) pendans au minimum 4h à 4°C en retournant de temps en temps les tubes de dialyse (et là c'est le drame: au bout d'1h le collagene gélifie dans les tube alors que normalement c'est pas censé faire ça. 1/2h ok, 1h gelifié...? alors que je retourne bien les tubes pour homogénéiser tout ca grace à la bulle d'air. 50ml en dialyse sérée avec une bulle d'environ 15ml pour homogénéiser)
-encore 3 autres dialyse, mêmes conditions
-stérilisation avec 3/1000 du volume en chlorophorme, sous légère agitation bouchon légèrement dévissé à 4°C


en théorie le collagene I est près à être utilisé, sauf que moi je suis obligé de le dilluer de facon plus qu'importante (+1/4 du volume en HCl pH=3)

donc voila si quelqu'un voit ou je me goure (surtout pour cette histoire de dialyse, 3 fois que je recommence, trois fois que ça me fait ça et trois fois que la personne qui en a deja fait me dit: j'ai jamais eu ca(quand elle regarde ce que je fait, y a rien d'abherant pour elle)) qu'il me le dise.


merci
-----

[invite07f30d6a]

PS: le collagene est sensé être solubilisé dans l'acide et s'abrège dans une solution saline (NaCl)

[Zellus]

Salut,

Tu extraits plus de collagène que la personne qui le faisait avant toi si je comprends bien ? Ca veut peut-être dire que tu manipules mieux qu'elle.
Vous partez exactement de la même quantité (ou masse) de queue au départ ?
Au final tu as du collagène plus concentré donc c'est bien ça ? C'est vraiment gênant pour la suite de tes manips ? Si tu le dilues juste n'est-ce pas suffisant ?
As-tu essayé de faire la même manip à partir d'un plus petit nombre de queues au départ ?
Désolé pour toutes ces questions ...

[invite07f30d6a]

Salut,

Tu extraits plus de collagène que la personne qui le faisait avant toi si je comprends bien ? Ca veut peut-être dire que tu manipules mieux qu'elle.
Vous partez exactement de la même quantité (ou masse) de queue au départ ?
Au final tu as du collagène plus concentré donc c'est bien ça ? C'est vraiment gênant pour la suite de tes manips ? Si tu le dilues juste n'est-ce pas suffisant ?
As-tu essayé de faire la même manip à partir d'un plus petit nombre de queues au départ ?
Désolé pour toutes ces questions ...

j'y avait pensé au bout de la 2eme fois, mais ma Do à 280 nm me donne la meme concentration que sont boulot
en plus au niveau sterilité, j'ai encore pas mal de chemin a faire

j'ai pas encore fini la troisieme fournée, mais le soucis, c'est que en tube de dialyse, au pire je devrait avoir un petit gel en surface mais pas sur l'ensemble de ma "solution"

pour les 2 premieres series j'ai en effet du faire comme ca et ca a marché au niveau du gel de culture (si ce n'etait la decouverte de levure dans la 2eme... )

c'est ce qu'on ma conseiller, bosser avec 3 plutot que 4...

mon gros souci, c'est que je commence a etre a court de temps pour mon boulot (jusqu'a septembre) et au niveau de mes manip il me faut 5 semaine pour finir mes constructions (une fois le collagen, mes cellules et mon bioreacteur pres) c'est pour ca que je commence a paniquer, d'autant plus qu'il y a a la clé un phd...ce qui serait vraiment

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite07f30d6a]

il semblerait bien que je bosse plus effficassement que la technicienne du labo... une simple dillution apres la premiere dialyse me permetteant de regler ce probleme... apparement
járrive a obtenir des gel homogenes et viable pour mes cellules (au premier regard pas encore fait mes constructions finales)

autre truc etrange, j´arrive encore a la meme concentration (toujours ~30mg/ml) alors que la dilution à ete faite au piffomettre

je te tient au courant quand a la sterilitée dans 2 jours

[invite07f30d6a]

bon ben le SDS PAGE a parlé, memes bandes, memes smir, donc ca doit etre la meme chose.
petite cerise sur le gateau, MON collagen I est mieux purifié que ce qui avait été utilisé pour des recherches precedente et qui aurait couté pour mes recherche "juste" 11000 euros....

[Zellus]

Hé bien félicitations !!

[invite07f30d6a]

"au cas ou":

si au court de la dialyse, on obteint un un gel et non une solution, la solution est de diluer le gel dans 1/4 de son volume d´ácide chloridrique à pH=3 (meme solution que la dialyse, pensez a filtrer steril et a travailler au maximum sous la hote dans des flacon sterilisés) sous agitateur magnetique tres lent une journée et une nuit, à 4°C et recommencer les dialyses une fois la preparation bien homogene

[invite1cf47ee1]

bonsoir a tous , je travaille sur la même thématique que vous mais j utilise le poisson au lieu des souris pour extraire le collagène . j ai un probleme au niveau du dosage du collagene trouve suite a l extraction pouvez vous me decrire celui que vous avez utiliser en citant les references ? merci d avance

[invitead2c07d9]

BONJOUR

Désolé je viens de m'inscrire.
Normalement on peut estimer la quantité du collagéne à partir du dosage d'hydroxyproline.

[invite07f30d6a]

désolé pour l'absence prolongée.
Le soucis de concentration venait en fait de ce que l'on utilise un nanodrop ("cuve" de 1mm) et que le protocole fourni indiquait un epsilon me donnant des concentration 10x supérieure... 1mm=0,1cm, à tenir compte si vos collègues bossent en routine et applique des choses sans savoir de quoi il retourne: A=EC seulement si la cuve fait 1cm sinon c'est à préciser l=0.1cm

handouch => La première méthode relativement fiable est la pesée séchée de ta solution. 2ml à 70°C jusqu'à évaporation complète de permet de déterminer la masse contenue. pour confirmer, j'ai estimé mon epsilon MASSIQUE à ~0,9 L.g-1.cm-1
fatibell => au moment je n'avait pas tout le nécessaire. plus tard cela à été fait en parallèle avec d'autres échantillons et c'est pas un truc que je voudrait faire en routine...