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Carte de restriction



  1. #1
    NaomieS

    Carte de restriction


    ------

    Bonjour !

    J'ai une question concernant un exercice de biologie moleculaire.
    J'ai 2 plasmides A et B ( le B dérive de l'autre par une mutation)
    Les 2 plasmides ont été digeré par la meme enzyme.
    On obtient 2 fragments pr le A (3000pb et 500pb)
    Et 3, pour le B . (500pb, 1000pb et 2000pb)

    On me demande de faire les cartes de restriction.
    Concernant le 2eme plasmide, y-t-il un ordre concernant les coupures?
    C'est a dire, dans ma carte, dois-je mettre d'abord 2000 puis 500 puis 1000

    -----

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  3. #2
    jmbowie

    Re : Carte de restriction

    J'ai pas essayé de rentrer dans les détails mais si ta molécule est vide, quelque soit l'ordre de tes fragments (A/B/C ou A/B/C), ça revient au même non ?
    Blast up your life!

  4. #3
    NaomieS

    Re : Carte de restriction

    Je pense que c'est pareil mais j'hesitais car la question d'après c'est de proposer des hypotheses concernant la mutation dans le plasmide B.
    Je ne sais pas s'il y a un lien ..

  5. #4
    Flyingbike

    Re : Carte de restriction

    vous pouvez remarquer qu'il y a un fragment en commun (500), et comme par hasard les deux autres fragments ont une taille qui devrait vous rappeler quelque chose (2000+1000)

  6. #5
    NaomieS

    Re : Carte de restriction

    J'ai remarqué que la taille des deux plasmides est la même: 3500pb
    Et ils ont, comme vous l'avez dis 2 fragments de 500pb.
    Mais en quoi cela me donnerai des indices aux hypotheses concernant la mutation ?

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    Flyingbike

    Re : Carte de restriction

    vous avez deux plasmides qui font la même taille, un fragment commun, et si on remarque que 1000+2000=3000, on peut très bien faire l'hypothèse que l'apparition d'un fragment supplémentaire est en fait du a la présence d'un site de coupure supplémentaire dans le fragment de 3000.

    Je vous en ai déjà dit beaucoup et je vous laisse réfléchir.

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  10. #7
    BioChemGuru

    Re : Carte de restriction

    Dessinez 2 cercles représentant les 2 plasmides de 3500 pb chacun.

    Combien de sites de restriction avez-vous besoin dans le plasmide A pour générer les 2 fragments de 3000 et 500 bp avec une seule et unique enzyme de restriction ?

    Idem avec le plasmide B pour générer les 3 fragments, en supposant qu'on utilise la même enzyme de restriction pour les 2 plasmides ? Où se situe le site de restriction surnuméraire et à quoi cela correspond-il concernant la mutation ?

    Si vous ni arrivez pas, refaites l'exercice avec 1 bout de ficelle de 35 cm de long. Attachez les 2 extrémités ensemble par un noeud afin de former un cercle. Combien de coups de ciseaux avez-vous besoin de faire pour générer un morceau de 5 cm et un morceau de 30 cm pour le plasmide A ? Répétez l'opération pour le plasmide B.

    Qu'est-ce qu'une carte de restriction ? Reportez les résultats sous forme linéaire en indiquant les sites de restriction pour le plasmide A et B...

    Cordialement,

    BCG

  11. #8
    NaomieS

    Re : Carte de restriction

    Pour le plasmide A j'ai besoin d'un site de restriction.

    Pour le plasmide B j'ai besoin de 2 sites de restriction.

    Le site de restriction surnuméraire se situe sur le fragment de 3000pb.

    Parcontre je n'ai pas très bien compris concernant la mutation..

  12. #9
    BioChemGuru

    Re : Carte de restriction

    Citation Envoyé par NaomieS Voir le message
    Pour le plasmide A j'ai besoin d'un site de restriction.
    Hélas, réponse incorrecte. Refaites l'exercice avec la ficelle de 35 cm fermée par un noeud pour le plasmide A. Je vous mets au défi de générer 2 fragments avec 1 seul coup de ciseaux. Que se passe-t-il après 1 seul coup de ciseau ? Quelle est la longueur obtenue ? Quelle est la conformation adoptée par la ficelle : linéaire ou super enroulée (supercoiled DNA) ?

    Pour le plasmide B j'ai besoin de 2 sites de restriction.
    Hélas, réponse incorrecte. Refaites l'exercice avec la ficelle fermée par un noeud pour le plasmide B.

    Le site de restriction surnuméraire se situe sur le fragment de 3000pb.
    Correct. A quel endroit exactement ? Pourquoi ? Comment expliquer l'apparition de ce site surnuméraire à cet endroit ?

    Parcontre je n'ai pas très bien compris concernant la mutation..
    La réponse se trouve dans l'explication juste au dessus. Essayez de réfléchir en quoi le changement d'une base dans le plasmide pourrait créer un nouveau site de restriction surnuméraire.

    Cordialement,

    BCG
    Dernière modification par BioChemGuru ; 27/02/2013 à 22h18.

  13. #10
    NaomieS

    Re : Carte de restriction

    Je comprend mieux, donc pour le plasmide A j'ai 2 sites de restriction et pour le plasmide B j'en ai 3.

    Les fragments de 1000pb et 2000pb forment le grand fragment de 3000pb chez le plasmide A. Il y a donc eu une mutation dans le fragment de 3000pb. Donc je peux emettre l'hypothese d'une substitution de paire de base dans ce fragment (3000pb)qui entrainerait une mutation du plasmide A en B.

  14. #11
    BioChemGuru

    Re : Carte de restriction

    Bravo, tout est correct, vous avez enfin trouvé les bonnes réponses à l'exercice demandé.

    "Concernant le 2eme plasmide, y-t-il un ordre concernant les coupures?
    C'est a dire, dans ma carte, dois-je mettre d'abord 2000 puis 500 puis 1000"

    Question subsidiaire : quels sont les solutions possibles au niveau de l'agencement des fragments issus du plasmide B ? L'ordre 5'-2000/500/1000-3' que vous aviez formulé est-il correct ? Pourquoi ?

  15. #12
    NaomieS

    Re : Carte de restriction

    Merci ! !

    Lorsqu'il y a un nombre de sites supérieur a 2, il y a un nombre élevé de cartes possibles. Dans le cas du plasmide B il y a 6 cartes possibles.

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  17. #13
    Enialix

    Re : Carte de restriction

    Salut,

    En fait non, il n'y a que deux cartes possibles car le plasmide est circulaire.

    La mutation n'est pas nécessairement une substitution, cela peut très bien être une insertion ou une délétion.

  18. #14
    BioChemGuru

    Re : Carte de restriction

    Hélas, 2 cartes sont possibles avec le plasmide A et 4 cartes sont possibles avec le plasmide B, que cela soit sous forme circulaire ou linéaire.

    1ère carte plasmide A : 5'-500/3000-3' (2 sites de restriction en positions 1 et 500)
    2ème carte plasmide A : 5'-3000/500-3' (2 sites de restriction en positions 1 et 3000)

    Qui peut les écrire les 4 cartes possible pour le plasmide B ?

  19. #15
    Enialix

    Re : Carte de restriction

    Désole de te contredire, mais tu ne peut pas définir une extrémité 5' et 3' pour un plasmide circulaire, tu a donc 1 possibilité pour A, et 2 pour B.

  20. #16
    BioChemGuru

    Re : Carte de restriction

    Citation Envoyé par Enialix Voir le message
    Désole de te contredire, mais tu ne peut pas définir une extrémité 5' et 3' pour un plasmide circulaire,
    Correct. J'ai adopté ce format d'écriture sous forme linéaire par soucis de clarté pédagogique en présupposant que le 1er site de restriction est en position 1 dans la séquence linéaire.

    tu a donc 1 possibilité pour A, et 2 pour B.
    Je ne vois pas en quoi une représentation linéaire d'une carte de restriction diffère de celle en représentation circulaire. Prenons un exemple concret où le 1er site de restriction se situe en position 278 sur le plasmide circulaire et le second en position 778 dans le premier cas de figure. Le second cas de figure peut alors être positions 278 et 3278, ce qui donne bien 2 cartes distinctes avec un plasmide circulaire A. Sur un gel d'agarose, on ne peut distinguer en l'état entre ces 2 possibilités car on a dans les 2 cas un fragment de 500 bp et un de 3000 bp visualisé après coloration au BET. Il faudra utiliser d'autres enzymes de restriction pour distinguer entre les 2 cas de figures évoqués ci-dessus.

    Le même exercice donnera 4 cartes avec le plasmide B. Le positionnement adéquat des 3 sites de restriction dans le plasmide B génère 4 cartes de restriction possibles dont les 3 fragments de 500, 1000 et 2000 pb permet déjà d'exclure la proposition de Naomie avec son agencement initial en 5'-2000/500/1000-3' (3 sites de restriction aux positions 1, 2000 et 2500 (ou bien aux positions 278, 2278 et 2778, comme vous voulez...)).

    Enfin dernier point, la mutation incriminée peut effectivement survenir par les 3 mécanismes que vous avez évoqués précédemment. En pratique au laboratoire, il est en effet très difficile voire impossible de distinguer sur un gel d'agarose entre un fragment de 1999 (délétion), 2000 (substitution) ou 2001 (insertion) bp.

    Bien cordialement,

    BCG

  21. #17
    Enialix

    Re : Carte de restriction

    Dans ce cas vous supposez encore que le plasmide a une base 1, hors c'est faux.
    La seule chose a retenir est qu'il y a un fragment de 500 et un fragment de 3000.
    Si on suit votre raisonnement, pourquoi un site serait en position 278? Il pourrait être en 279, 280, ..., ce qui donne des milliers de possibilités.
    Dans le cadre de l'exercice, avec les données fournies, une seule carte est possible, un cercle de 3500 pb, avec 2 sites de restrictions espacés de 500 pb.
    Que vous les dessiniez en haut, en bas, a gauche, a droite (pour ne pas reprendre la chanson) ne change rien au problème, ce sera toujours la même carte.

    En suivant ce raisonnement, je maintiens qu'il y a bien 1 possibilité pour A, et 2 pour B.

    Amicalement,
    Enialix

  22. #18
    dezmounaa

    Re : Carte de restriction

    quelle est la difference entre hydrolyse simple et double svp?

  23. Publicité

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