Bonsoir à tous
alors voilà, je prépare un TP de biochimie qui a pour but d'identifier les sucres qui composent l'orange et le citron et pour ce faire, on nous demande de mélanger les jus avec de l'éthanol avant de les centrifuger deux fois..pourquoi? (s'en suit une CCM)
Merci d'avance!
Je ne trouve que quelques brèves informations, sans aucune explication, ou il est question d'éviter l'hydrolyse, ou alors des histoires de cristallisation..mais rien de plus!
Des histoires d'agents de fixation aussi..mais je n'y comprends rien!
Vraiment personne? Même si ce n'est qu'une histoire de solvant, dans ce cas je souhaiterai simplement savoir pourquoi plutôt de l'éthanol que de l'eau..je suis allé jeter un petit coup d'oeil sur les solubilités des différents sucres et ça ne me semble pas expliquer ce choix..ou alors ce serait pour linéariser les glucides cycliques?
Pour neutraliser les enzymes en les dénaturant est la réponse la plus plausible que j'ai trouvé.. Je vais partir là-dessus, mais je suis toujours ouvert à une confirmation, ou bien une autre proposition!
Bon, je vois que je me fais une discussion tout seul ^^
Mais je vais continuer, on ne sait jamais..
Ma prof souhaite me faire réfléchir un peu, mais c'est ce que je fais depuis des lustres et je ne trouve toujours pas!
Apparemment, ce serait une histoire de solubilité..
Pour moi, l'eau et l'éthanol sont tous les deux des solvants polaires, la seule différence est la présence d'un groupement alkyle, donc apolaire, sur l'éthanol..Mais il est tellement petit que je ne vois pas en quoi il peut avoir de l'importance! Mais admettons.. Ca voudrait donc dire que l'éthanol permet de solubiliser tous les constituants du jus d'agrume? Le problème, c'est que je m'attends à trouver du fructose, du glucose et du saccharose, je ne vois donc pas bien pourquoi j'aurai besoin d'un solvant en parti apolaire.. Ou dois-je partir du principe que, ne sachant pas quels glucides je vais y trouver, il en existe qui sont solubles dans les solvants apolaires et que donc, dans le doute, on utilise de l'éthanol?
SVP, aidez moi!! J'aimerai pouvoir anticiper mon compte-rendu mais je ne peux pas tant que je n'ai pas cette information!
Ou bien pour faire précipiter l'ADN et ainsi éviter de le retrouver dans notre CCM..
Avez-vous le protocole ?
Haaaaa, peut-être un sauveur!
Voici le protocole :
Presser les fruits dans 2 béchers distincts. Dans un tube à centrifuger, introduire 1 mL de jus de fruit et 3 mL d’ethanol (x2). Mélanger, laisser reposer qq minutes et centrifuger 5 minutes à 4000 tour/mn.
Activer les chromatoplaques à l’étuve à 100°C pendant 5 minutes. Marquer légèrement la ligne de dépôt au crayon graphite à 1,5 cm du bas de la plaque. Indiquer les emplacements des 9 dépôts.
les 7 témoins*: xyl, ara, glc, man, frc, sacch, lac
les 2 surnageants des jus de fruit
Déposer une goutte de chaque solution. Les spots doivent être les plus petits possibles. Laisser 1 cm de chaque coté. Placer la plaque dans la cuve et laisser migrer le solvant. Laisser le développement se poursuivre jusqu’à ce que le solvant soit à 1 cm du haut de la plaque.
Sortir la plaque et marquer légèrement la ligne de front de solvant. Laisser sécher. Sous la hotte, pulvériser le réactif de Molisch ou le réactif au naphtylaminethymol. Développer la coloration à l’étuve à 110°C pendant 15 minutes.
Je pense que l'éthanol sert à se débarrasser des protéines et des nucléotides (ADN, ARN) qui perdront leur solubilité et précipiteront plus facilement à la centrifugation.
La réaction de Molisch a besoin d'eau, mais le surnageant en contenait à la base. L'alcool s'évaporera de toute façon au cours du séchage. Exit donc le rôle de solvant alcoolique.
En espérant voir avoir aidé
__________
PS : Dans des cas comme présentement, n'oubliez pas de préciser le contexte en donnant systématiquement le protocole suivi
Hum hum, merci beaucoup noir_ecaille, c'était donc ma dernière hypothèse la bonne!
Comme d'habitude, je vais chercher beaucoup trop loin..J'ai trop focalisé sur les glucides alors que c'était juste pour se débarrasser du reste!
Et oui, merci du conseil pour le protocole, j'y penserai la prochaine fois!
Merci encore et bon week-end à vous/toi(?) ^^!
Dernière modification par invite876467890 ; 10/03/2013 à 00h24.
Bonjour
je reviens vers vous car je souhaiterai savoir, au cas ou l'éthanol servirait bel et bien à faire précipiter l'adn, quel est le mécanisme mis en oeuvre?
Mon hypothèse est que la partie polaire de l'éthanol va venir se fixer à l'ADN et que sa partie apolaire va repousser les molécules d'eau..mais je souhaiterai confirmation!
C'est un petit peu différent.
En fait l'ajout d'éthanol va changer/déséquilibrer la charge en électrolytes du mélange. Comme il y a moins de liaisons ioniques avec les phosphates de la molécules d'ADN, cela va changer la solvatation de l'ADN. S'ajoute par-dessus la polarité inférieur de la molécule d'éthanol qui modifie les liaisons hydrogènes et polaires du mélange, ce qui change encore la solvatation de l'ADN.
Au final, l'ADN n'a plus assez de liaisons avec son solvant et précipite.
Merci beaucoup noir_écaille, ça a l'air complet comme réponse, mais j'avoue que je n'ai pas tout saisi..
Je ne comprends pas comment l'alcool modifie les charges en électrolytes du mélange..en fait, dans toutes les explications que je trouve, on ajoute de l'éthanol et du sel, dans ce cas je peux comprendre, mais dans mon protocole, on ne nous parle nulle part d'en ajouter..et dans ce cas, si les ions Na+ viennent se lier au charges négatives de l'ADN, je comprends que ce dernier ne puisse plus effectuer de liaisons hydrogènes avec le solvant.. Et donc, ça aurait pu fonctionner avec de l'eau aussi, mais puisque, comme vous le précisez, le moment dipolaire de l'éthanol est inférieur, alors l'ADN précipitera encore plus facilement dans ce solvant..c'est bien cela?
Reste seulement le problème du sel alors, pourquoi n'en ai-je pas besoin? Ou alors, comment l'éthanol peut il à lui seul neutraliser les groupements phosphates de l'ADN?
Dernière modification par invite876467890 ; 11/03/2013 à 19h50.
Voici l'explication que j'ai trouvé :
Le sel permet de neutraliser les charges négatives (portées par les groupements phosphates) de l’ADN en éliminant les molécules d’H2O qui entoure la double hélice. Cela permettra ainsi sa précipitation dans l’alcool.
Et j'ai du mal à faire le lien entre cette explication et d'autres..
Si jamais quelqu'un d'autre passe par cette discussion ce soir et pense pouvoir m'expliquer le phénomène, ce sera avec grand plaisir, j'aimerai bien pouvoir en parler un peu dans mon compte rendu de TP de demain..
Dernière modification par invite876467890 ; 11/03/2013 à 20h47.
Bon, bah ce soir j'aurai appris qu'à présent, il vaut mieux que je fasse mes recherches en anglais
Ethanol is much less polar than water; its dielectric constant is 24.3 (at 25 °C). This means that adding ethanol to solution disrupts the screening of charges by water. If enough ethanol is added, the electrical attraction between phosphate groups and any positive ions present in solution becomes strong enough to form stable ionic bonds and DNA precipitation. This usually happens when ethanol composes over 64% of the solution.
Wikipedia..
En tout cas merci beaucoup noir_ecaille!
Ah, désolée pour la confusion ^^;
Quand je parle de modifier la charge du mélange, c'est en proportion -- comme on ajoute un liquide qui ne se dissocie pas en électrolytes, on diminue la proportion ou pourcentage d'électrolytes du mélange.
Alors que l'eau se dissocie ainsi :
2 H2O <===> H3O+ + OH-
L'éthanol, tout polaire qu'il soit (et moins que H2O), va proposer moins de liaisons hydrogène et aucune liaison ionique
Mais de ce que j'ai compris, c'est ce qu'on veut des liaisons ioniques?
J'ai compris ça : en ajoutant de l'éthanol en excès, on fait disparaître les molécules d'eau qui établissaient des liaisons hydrogènes avec l'ADN, donc dans un premier temps, c'est l'éthanol qui fait office de solvant à présent. Et dans un milieu sans électrolytes, l'ADN reste soluble dans l'alcool..Mais les électrolytes présents dans la solution vont maintenant pouvoir se lier aux groupements phosphates de l'ADN, ce qu'empêchait l'eau mais pas l'alcool, puisqu'il est moins polaire. Ainsi l'ADN est neutralisé et précipite dans l'éthanol..
Qu'en dites vous?
J'ai tendance à penser que les ions sont plus solubles dans l'eau que dans l'éthanol, à quelques exceptions près.
Maintenant on peut éventuellement demander à la modération de basculer ce topic en section chimie pour avoir plus de précisions sur les mécanismes en jeu dans cette précipitation.
Bon et bien j'ai eu mon TP ce matin et à ce que m'a dit ma prof, je me suis cassé la tête pour rien..C'était simplement une histoire de solubilité, il me semblait pourtant que le fructose l'est mois dans l'éthanol, j'ai du me tromper..mais je serai incapable de vous redonner son explication maintenant! Je crois que ça avait à voir avec la forme cyclique du fructose (fructofuranose), qui lui conférerait certaines propriétés d'apolarité à des endroits bien particuliers..et que c'était d'autant plus efficace si on considère que l'éluant utilisé pour la CCM contenait du n-butanol et de l'acétone..
Je vais essayer de lui en reparler à un prochain cours et je ne manque pas de vous tenir au courant!
En ce qui concerne le déplacement de cette discussion en chimie, je l'y ai laissée quelques jours sans avoir aucune réponse, vous êtes vraiment la seule a avoir essayé de m'aider, je ne peux que vous en remercier!
Autre petit soucis : j'ai passé aussi des heures à essayer de comprendre pourquoi on travaillait avec du tampon phosphate à pH=7 alors que, comme précisé dans le protocole, l'oNP a une coloration jaune seulement en milieu alcalin..Et pourtant, ça a fonctionné, je me fierai moins à la rigueur des protocoles que l'on nous donne à présent..
Dernière modification par invite876467890 ; 12/03/2013 à 18h46.
Certainement qu'il y a une histoire de solubilité sucres-éthanol -- sinon on ferait précipiter les autres molécules par un autre moyen je pense.
Ce qu'a dit votre prof concernant les cycles furanoses a aussi une influence puisqu'il faut déshydrater à l'acide ces cycles pour obtenir des furfurals (pentoses) ou hydroxymethylfurfural (hexoses). Ce que j'ignorais, c'est que les états cycliques des sucres fussent plus solubles dans l'éthanol que dans l'eau.
Remerciez votre prof de ma part, surtout s'il peut compléter notre explication
Pour "l'oNP", j'avoue ne pas retrouvé ce que c'est en abrégé... ^^;
Hum, concernant la meilleure solvatation des sucres à l'état cyclique, c'est bien ce que j'ai cru comprendre, mais je ne préfère pas trop me prononcer sans avoir obtenu de plus amples informations..
Concernant l'oNPG, c'est un hétéroside qui, sous l'action de la β-galactosidase, libère du galactose et de l'oNP (orthonitrophénol).
Après quelques recherches, j'ai cru comprendre qu'on pouvait l'utiliser pour certaines identifications bactériennes :
la β-galactosidase est sécrétée par escherichia coli et permet l'hydrolyse du lactose en galactose et en glucose, mais il arrive que certaines bactéries soient reconnues Lactose (-), alors qu'elles possèdent bien la β-galactosidase mais pas la perméase assurant le transport du lactose.
On parle alors de Lactose (-) "vraie" et de Lactose (-) "lente" :
- si une Lactose (-) est déterminée oNPG (+), c'est qu'elle possède la β-galactosidase mais pas les perméases nécessaires.
- si elle est reconnue Lactose (-) et oNPG (-), c'est qu'elle ne possède ni la β-galactosidase, ni les perméases.
Il y a aussi beaucoup de références à des mutations, et je ne sais plus quel terme en "ron" renvoyant au fait que les gènes bactériens peuvent coder pour différentes protéines (ce n'était pas intron ou exon..) mais je n'ai pas approfondit le sujet, alors si quelqu'un peut venir éclairer un peu
Et je pense à revenir dès que j'en sais un peu plus!
Dernière modification par invite876467890 ; 12/03/2013 à 19h38.
Vu qu'une partie de mon post n'est pas passée...
Comprendre les mécanismes sous-jacents à certaines réactions ou à certains comportement ne vous servira pas dans l'immédiat. Néanmoins à terme cela vous autorisera à adapter certains protocoles à des conditions particulières, voire en inventer un de novo là où tous les autres échoueraient -- ça demande quand même d'avoir les méninges bien accrochées !Envoyé par loulou_d
Continuez de cultiver votre curiosité. Éduquée, c'est une très grande et très précieuse qualité
En général, ce que nous étudions en chimie nous permet de comprendre ce que nous faisons en biologie/biochimie, mais il n'est pas toujours évident de faire le lien et même si cela dépend surement des universités, des enseignants, du nombre d'heures de cours trop souvent insuffisant, je regrette que certaines explications des mécanismes mis en jeu dans nos protocoles de TP ne soient pas proposées.. Mais c'est aussi à nous, étudiants, d'aller à la pêche aux informations, on retient même plus facilement je trouve, lorsqu'il s'agit d'infos complémentaires et avec tous les moyens mis à notre disposition, BU, internet, FS
Dernière modification par invite876467890 ; 12/03/2013 à 20h20.
