Problemes en Biochimie: Fixation de ligands et cinetique Michaelienne

[invite23118b8a]

Bonjour à tous,
Je fais mes études par correspondance et je rencontre de gros problemes en Biochimie au niveau de deux exercices, un concernant la fixation de ligands et l'autre traitant de la cinétique Michaelienne. J'ai eu beau avoir lu des milliers de fois le cours et m'aider d'internet je n'arrive pas a traiter ces exercices qui pourraient pourtant m'aider à maitriser correctement mon cours. Voici les énoncés:
FIXATION DE LIGANDS
A partir d’une souche sauvage de E. coli, un expérimentateur purifie une protéine dont la
masse moléculaire mesurée par méthode osmométrique est 540 000 Daltons. Cette protéine Po
présente de l’affinité pour un effecteur L.
a) Dans une première série d’expériences, l’expérimentateur mesure, par dialyse à
l’équilibre, à concentration fixe en protéine Po (Po = 0.5 10-4 mole.L-1) et à concentration
variable en effecteur, la fixation de L à Po
Llié mole.L-1 1.25 10-5 2.3 10-5 4.0 10-5 5.2 10-5 6.8 10-5 8.25 10-5
Llibre mole.L-1 1 10-6 2.2 10-6 4.7 10-6 7.9 10-6 1.5 10-5 3.20 10-5
1) Montrer que 1/Llié = f (1/Llibre) ou Llié/Llibre = f(Llié) sont des relations linéaires.
2) Etablir le(s) graphique(s) correspondant(s).
3) Déterminer le nombre de site de liaison de L par mole de Po et la constante de
dissociation du complexe Po L.


CINETIQUE MICHAELIENNE
On étudie une cinétique michaéliennne à un substrat dans des solutions (10 mL)
contenant 4,5 10-7 mol.L-1 d'enzyme. On mesure les concentrations en produit P formé après
10 minutes pour des concentrations initiales S0 en substrat croissantes:
[S]0 1,25 3,00 12,50 35,00
mol.L-1 X104
[P] 100 210 500 700
mol.L-1 X106
1-Ecrire l'équation de MICHAELIS-MENTEN en précisant la signification de tous les
termes. Donner l'expression de la constante de MICHAELIS en fonction des constantes de
vitesse.
2-Déterminer les paramètres cinétiques (Km et Vmax) à l'aide de la représentation linéaire
d'Eadie-Hofstee de l'équation de MICHAELIS-MENTEN.
Sans modifier la concentration de l'enzyme, est-il possible d'obtenir 1400 10-6 mol.L1 de
produit en 10 minutes? Justifier votre réponse.
3-Quelle concentration d'enzyme faudrait-il utiliser pour obtenir cette quantité de produit
en 10 minutes, en partant d'une concentration en substrat de 35 10-4 mol.L-1.
4-Calculer le nombre d'unités internationales (1 U.I.=quantité d'enzyme qui transforme
1μmole de substrat par minute) dans le milieu.

Je vous remercie d'avance pour toute l'aide precieuse que vous pourrez m'apporter !!
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[invite629c41dc]

1-Ecrire l'équation de MICHAELIS-MENTEN en précisant la signification de tous les
termes. Donner l'expression de la constante de MICHAELIS en fonction des constantes de
vitesse.

Tu n'as pas réussi à répondre à cette question?
Quel vache de prof!

Il te donne un exo et tu dois inventer la formule :s

[invite629c41dc]

1) Montrer que 1/Llié = f (1/Llibre) ou Llié/Llibre = f(Llié) sont des relations linéaires.

Question bizarre quand on lit la question qui suit juste après. Pour moi, un graphique aurait dût suffire.
Si tu ne sais pas trop quoi faire, je propose de calculer les rapports delta y / delta x
avec x = 1/Llié
et x = 1/Llibre
Tu calcules ces différences entre la première mesure et toutes les autres.
Tu diras que les rapports sont proches.
Donc la relation est linéaire.

3) Déterminer le nombre de site de liaison de L par mole de Po et la constante de
dissociation du complexe Po L.

Bon, combien de sites de liaison?
Trop fastoche <3
On a 2 inconnues : le coefficient stoechiométrique "a" dans la réaction aL + Po = PoLa
Et l'autre inconnue : Kd

Il nous suffit d'avoir 2 équations.
On en a donc largement assez.

Il va juste falloir faire attention! On ne peut pas parler de la concentration en protéines libres : cela ne signifie pas grand chose car il y a des protéines totalement libres et d'autres avec 1 ou 2 ou 3 voire plus de ligands liés mais qui ne sont ni complètement liées ni complètement libres.

On écrit Kd = [L] x [sites libres] / [siteL]
de plus, [sites libres] = [sites]totale - [sites liés] = a x [Po] - [Llié]

Kd = (1x10^-6) x (a x 0.5x10^-4 - 1.25x10^-5) / (1.25 x 10^-5)
Kd = (3.20x10,-5) x (a x 0.5x10^-4 - 8.25 x 10^-5) / (8.25 x 10^-5)
Donc (1x10^-6) x (a x 0.5x10^-4 - 1.25x10^-5) / (1.25 x 10^-5) = (3.20x10,-5) x (a x 0.5x10^-4 - 8.25 x 10^-5) / (8.25 x 10^-5)

YOUPI on a une équation avec une seule inconnue

[invite629c41dc]

0,20625a = 32
soit a = 155

On a donc 155sites de fixation de ligand sur chaque protéine.

Po + 155L = PoL155

Kd = [Po] x [Llibre] /[PoL]
[Po] = [sites libres]/155 = (a x [Po] - [Llié]) / 155

Dans le cas où Llibre est de 3.2 x 10^-5, on a donc [Po] = (155 x 0.5 x 10^-4 - 8.25x10^-5) / 155 = 4.95 x 10^-5 mol/l

Kd = 4.95 x 10^-5 x [3.2x10^-5]^155 / (8.25x10^-5)
Kd = 0

La fin paraît un peu bizarre.
Mais je ne crois pas avoir fait d'erreur.

J'ai bien vérifié longtemps le calcul de a et il ne me semble pas m'être trompé.
Vérifie et si tu obtiens bien un nombre de sites de fixation de 155, il est normal d'obtenir une constante de dissociation si faible puisque il y a énormément énormément de sites de fixation.

Bien joué, il est 3heures du mat à cause de toi.

Tu m'excuseras de ne pas m'attaquer au deuxième problème j'espère.
Quand je pense que je viens de passer au moins 5heures sur cet exercice et que ça ne me servira probablement à rien puisque je souhaite passer l'internat en pharmacie et que on dispose de 20minutes pour faire 1exercice.
Il serait surprenant que ce soit un exercice dans le genre qui tombe... ^^

Bref, bon courage pour tes exo!

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite629c41dc]

vi = vmax x S / (Km + S)
vi : vitesse initiale
Km : constante de Michaelis et Menten, spécifique de l'enzyme.
S : concentration en substrat


http://www.google.fr/imgres?imgurl=h...9QEwBA&dur=360

(en ordonnée tu as la vitesse initiale, c'est-à-dire la concentration en produit que divise le temps)
(en abscisse, tu as la vitesse initiale que divise la concentration en substrat, fastoche)
Tu traces ta droite sur Open office par exemple comme moi.
Tu obtiendras une droite d'équation f(x) = -0.001x + 9x10^-5
Tu en déduis que Km = - pente = 10^-3
Vm = 8x10^-5 mol/l/min

La vitesse maximale est de 80 µmol/L/min.
En 10minutes, avec la quantité d'enzymes qu'on a, on pourra donc atteindre une vitesse méga maximale de 800 µmol/l
On ne pourra donc jamais atteindre les 1400 µmol/l/10minutes, quand bien même nos enzymes sont saturées en permanence.


Le Km est spécifique de l'enzyme.
On peut considérer que la vitesse est maximale étant donné la très forte concentration en substrat (il me semble?).
De toutes façons si la vitesse n'est pas linéaire, on ne peut rien faire.
Mais normalement, il faudrait que la [S] > 10Km (ce qui n'est pas le cas)
Du coup, c'est un peu bizarre :s
Je suis désolé mais dans ce qui suit je me suis trompé alors regarde le tout dernier paragraphe pour que tu puisses le résoudre ton problème quand même.


C'est une question piège? ??? ^^
Si on considère que la vitesse est linéaire est maximale. (ce qui est faux puisque comment on le voit avec Eadie Hofstee, la vitesse varie en fonction de la concentration en substrat). Le substrat n'est donc pas considéré largement en excès.


Nous avons 4,5 10-7 mol.L-1 d'enzyme ---> cela transformerait 80x10 µmol/l en 10minutes
Combien d'enzymes faut-il pour transformer 1400µmol/l en 10minutes?

On fait les produits en croix : 4.5x10^-7 x 1400 / 800 = 7.88 x10^-7 mol/L d'enzymes.
Il faut donc 7.88x10^-7 mol/L d'enzymes pour obtenir 1400µmol/L de produit en 10minutes (en considérant que le substrat est en excès).


On sait que 4,5 10-7 mol.L-1 d'enzyme (dans 10mL soit 4.5x10^-6 moles d'enzyme) transforme 80µmol/L de substrat (dans 10mL soit 800µmol par minute)
On veut savoir quelle quantité d'enzyme transforme 1µmol de substrat par minute.

Bah la pareil, les produits en croix.
4.5x10^-6 x 1 / 800 = 5.63 x 10^-9 moles d'enzymes
5.63x10^-9 moles d'enzyme transforment (à vitesse maximale) 1µmole de substrat par minute.



En fait, je me suis planté.
J'ai dit qu'on était à vitesse maximale mais ce n'est pas vrai.
Je n'ai pas la foi de tout refaire.
Le truc c'est de ne pas considérer qu'on est à vitesse maximale.
Il va falloir calculer la vitesse grâce à Eadie et à Hofstee.
Il te faut connaître la concentration et après tu calcules la vitesse à laquelle tu te trouves.
vitesse = -0.001 x (vitesse/[S]) + 9x10^-5
Il te faut connaître la concentration en substrat pour que ton équation n'ait qu'une seule inconnue.
Désolé d'avoir raconté des conneries.

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