Page sds
Bonjour à tous,
Voilà je voudrais savoir quel est le voltage adéquat pour séparer de protéines de 280 et 290 kDa, sachant que jusqu'à maintenant je n'ai pas pu le faire en utilisant des gel de 4-12% et 3-8% à 200V. Je sais qu'avec un SDS-PAGE la charge des protéines n'a pas de roles sur mobilité mais le voltage peut-il jouer un rôle sur la résolution de la séparation?
Merci pour vos réponses
Bonjour,
plus le voltage est élevé, la séparation des bandes est rapide mais lors de la révélation la séparation des bandes sera moins nette. Pour certains protocoles nous réalisons des migration à faible voltage durant plusieurs heures.
Bonjour,
Je suis complètement d'accord avec sebastien_cha. Je rajouterai en plus que tes protéines sont de poids moléculaire élevé, donc difficile à séparer. Et en plus rapproché de 10kDa, donc encore plus difficile de les différencier l'une de l'autre nettement. donc vraiment dure à séparer. Enfin, dernier point, j'espère que les protéines ont un niveau d'expression similaire, sinon, cela sera extrêmement difficile.
Dans tout les cas, je pense que tu n'échapperas pas à une migration faible voltage sur la nuit (avec gel 3-8%)
微生物
En fait la deuxième protéine de 290 kD est une version mutée de la protéine à 280 kD, elle est moins exprimée que cette dernière environ 30 % de la normale, dans mon cas, j'essaye de voir si les deux protéines sont présentes simultanément ou pas et dans l'idéal déterminer la proportion de la protéine mutée en utilisant l'actine comme témoin interne. Pouvez vous me proposer un protocole?
30% de différence, ce n'est pas beaucoupJe pensais à 5 ou 10 fois la différence...
Mais le problème sera toujours le même, tu ne pourras pas différencier tes deux protéines (qui en plus sont semblable).
Je n'ai jamais été un pro des migrations longues durées, mais dans le cas de grosses protéines, je réaliserai un migration de 6-8h (donc sur la journée) à 80-100V (l'idéal serai que la bande des 250kDa de ton marqueur de taille soit au milieu de ton gel). Tu va donc faire sortir du gel toutes les protéines de faible poids moléculaire. Attention, le temps que j'indique est au pif : il va falloir surveiller ton gel (toute les heures, je dirai).
Si ce n'est toujours pas bon, tu peux lancer la migration pendant 16h (sur la nuit) à 60V. Le lendemain, tu check l'avance des bandes du marqueur, et tu peux accelérer à 100V pour plusieurs heures si ce n'est toujours pas bon.
Pour la concentration du gel, le mieux est de testet les deux, mais si tu n'as pas le choix, prilivigie le 3-8% (la crainte avec un gel plus concentré étant que les grosses protéines ne rentrent même pas dans le gel).
Et dernier point, pense à réaliser ta migration au frais, surtout pour les 16h! (en chambre froide, à 4°C, c'est l'idéal!)
En espérant avoir aidé
微生物
Merci pour ta réponse biseibutsu, juste pour correction en fait ce n'est pas 30% en moins mais 30% tout court, mais selon ce que t'as dit, ça ne change rien.
J'ai pensé à utiliser un gel à 6% sans gradient à 150 Volt, faire migrer jusqu'à avoir la bande 250 au milieu du gel, qu'est-ce que t'en pense?
Il faut tester
Et là, tu entres dans la voie de l'expérimentation, attention, c'est dur
Sérieusement, je ne vois pas pourquoi cela ne marcherai pas, ce que tu viens de décrire. En fait si, un ou deux points à préciser :
Premier point : ajoute tu bien du beta-mercapto pour détruire les ponts dissulfure des protéines? (réduire est le terme exact, si je ne m'abuse)
Second point : une migration trop rapide peut "emmeler" (désolé, j'ai perdu le bon mot) les protéines, comme l'a dit sebastien_cha au début du poste, donc si 150V ne fonctionne pas, pas de panique, diminue juste le voltage dans un premier temps
Hop, réponse rapide, désolé, si tu as d'autre question, je répondrai demain
微生物
En fait j'utilise du DTT "Dithiothréitol" à la place du bétamercaptoéthanol.
Thanks
Normalement, pas de problème, sauf si tu utilises de DTT dans des conditions de pH extrème. Ce que je ne pense pas
La seule différence notable, c'est que le DTT pue moins que le beta-mercapto... Chanceux, va!
微生物
Bonjour à tous,
Je profite de ce topic autour du page-sds pour vous demander un éclairage de ma lanterne s'il vous plaît. Nous avons évoqué cette technique de séparation des protéines selon leur masse dans le cadre de mon master 2, mais les protéines étant de composition en acides aminés différente, avec ce que ces derniers peuvent avoir de fonctions acides ou basiques différentes, je n'arrive pas à comprendre comme la charge globale d'une protéine dénaturée au page sds peut être la même entre deux protéines différentes.
Re-bonjour, car cela fait comme même plus de deux ans!
Pour répondre à ta question, c'est la magie du SDS. Le SDS va se "coller" (à l'aide de pont hydrogène, si je ne me tyrompe pas) sur la protéine dénaturée, et va ainsi masquer les différentes fonctions chargées de la protéine. Et sachant que le SDS se fixe sur la protéine avec un ratio constant (1.4g de SDS pour 1g de protéine), la charge globale d'une protéine dépends alors uniquement de sa longueur en acides aminés, et du coups, de son poids moléculaire.
En espérant avoir été assez clair!
微生物
Bonjour,
Je ne voulais pas ouvrir un nouveau topic pour ma petite question, je pensais bien faire en squattant un topic approprié au sujet
Merci bien pour la réponse ! Bon, j'ai encore cherché à côté et donc, si j'ai bien compris, c'est la partie hydrocarbonée (et non la tête polaire du sds) qui interagit d'où l'effet "masquant" décrit dans ta réponse
Dernière modification par Macrophage ; 04/02/2016 à 21h54.
Comme tu dis.
La différence en poids moléculaire (et donc longueur et/ou complexité) entre protéines est énorme. Mais la dénaturation est là pour simplifier leur structure (il n'est censé resté que la structure primaire), et le SDS va camoufler les acides aminés de la protéine et en profiter pour uniformiser la charge.
Sinon, attention, le ratio que j'ai indiqué est determiné pour un lysat cellulaire. Donc une mixture complète protéique dont on ne sait pas trop de quoi c'est composé. Il est possible de calculer le ratio quantité SDS/quantité protéine (si la protéine est purifiée par exemple). Je ne me souviens pas de la formule de tête, mais de toute façon, on préfère mettre le SDS en excès lors de la dénaturation et lors de la migration (histoire d'être sur...)
微生物
Merci beaucoup (encore) pour ces précisions ^^
