Le HGF décolle mes cellules ?

[invite165f31bc]

Bonjour,

Je viens vers vous car je suis en pleine perplexitude. Je cultive des cellules MDCK sur des lamelles préalablement coatées au collagène de type IV (50µg/ml).
Je suis censée ajouter le facteur de croissance HGF à 5ng/ml pour mimer une tension sur les cellules (HGF étant connu pour induire la migration et la transition épithélio-mésenchymateuse). Pour que l'effet du facteur soit davantage caractérisé, je cultive 24h avant l'ajout d'HGF mes cellules en milieu appauvri en FBS (0,5%).
Je dois fixer mes cellules à différents temps puis faire des immunomarquages et voir l'effet du HGF sur certaines molécules d'adhésion cellule-cellule. J'utilise pour fixer du PFA 4% dans du sucrose.

J'ai remarqué que l'ajout de l'HGF semblait induire le décollement de la majorité des cellules, donc il en reste très peu pour les marquages ! Si le HGF induit des mitoses, je suppose que certaines se décollent et partent au moment de vider le puits pour fixer, mais là ça part carrément en lambeaux.

J'ai fait des tests sur mes lamelles avec des milieux appauvris ou non pour voir si le problème vient du coating ou du milieu, mais visiblement le décollement n'a lieu qu'en présence d'HGF.
Comment cela peut-il être dû au HGF (j'utilise des aliquots congelées qui ne sont pas de moi mais qui ont été utilisés récemment par qqn d'autre sans problème) ?
De nombreuses publi utilisent le HGF et parfois même à des concentrations beaucoup plus importantes que la mienne (jusqu'à 250ng/ml) et cela n'a pas l'air d'avoir cet effet.
Auriez-vous une idée ?
Mon stage se termine bientôt et ma partie "résultats" est bien vide

D'avance merci,
luminou
-----

[noir_ecaille]

Hypothèse : si HGF induit une migration, il se peut que les cellules larguent au moins partiellement les amarres -- pour se fixer ailleurs, là où la concentration en HGF diminue.

Peut-être une neutralisation de HGF est-elle nécessaire avant l'immuno-marquage, ou bien au contraire raccourcir l'exposition à HGF afin que les cellules soient sensibilisées mais pas toutes complètement décollées.

[invite165f31bc]

Il me semblait qu'elles larguaient les amarres qu'elles ont entre elles (les cadhérines) mais pas celles qui les attachent à la matrice (les intégrines sur mon collagène), pour migrer tout en restant liées au support. En revanche si elles font une transition épithélio-mésenchymateuse complète, là oui en effet...

La neutralisation du HGF n'est pas mentionnée par les auteurs qui ont utilisé le HGF comme inducteur de tension, je ne pense pas qu'ils le fassent.

Pour tester à des temps plus courts c'est déjà fait, je fixe à partir de 15 minutes puis régulièrement jusqu'à 30h, et on voit l'effet de dispersion des cellules vers 3-6h, mais seulement sur quelques îlots de cellules.
A 24-30h, les quelques îlots qui ont résisté ne montrent pas cette dispersion, soit parce que le HGF ne fait plus effet, soit parce que les îlots sur lesquels ça a fonctionné sont partis dans la nature !
Je ne suis plus sûre du temps d'exposition dans la littérature, je vais regarder.

Merci d'avoir répondu =)

[invite165f31bc]

J'ai peut-être une explication : je fixe au PFA régulièrement mais je fais ça dans des plaques avec des puits destinés à être fixés plus tard...et pendant les 10min d'incubation en PFA je remets ma plaque à l'incubateur pour pas les stresser. Mais du coup elles se prennent peut-être des vapeurs de PFA et meurent au bout de 24/30h ? Surtout les derniers puits qui prennent ça plusieurs fois.

[A voir en vidéo sur Futura]

[noir_ecaille]

De ce que je lis du paraformaldéhyde dans Wikipédia, c'est carcinogène plutôt que cytotoxique. La DL50 est raisonnable. J'ai un peu de mal avec l'appauvrissement en sérum bovin foetal -- n'étant pas laborantine, l'intérêt m'échappe un peu. Peut-être que cela incite les cellules à migrer plutôt que se multiplier (je suppose).

Ou alors vos cellules MDCK décongelées ont du mal à se fixer ? Elles ont quelle tête avant ajout de HGF ?

[invite165f31bc]

Vous parlez de la DL50 orale sur rats ? Je ne pense pas que ça soit pareil sur des cellules et c'est surtout en inhalation que c'est toxique, du coup je ne sais pas trop comment utiliser cette info
Le sérum bovin booste les cellules, tout comme le HGF. Pour mieux voir un éventuel effet du HGF, on réduit le SVF avant pour "amplifier" l'action du HGF. L'effet est moins visible si on garde le taux de SVF optimal.
Les cellules se fixent très bien dans les conditions sans HGF, 10% de sérum et même 0,5% de sérum, elles sont très jolies =)

[noir_ecaille]

Avez-vous essayer en repiquant les quelques cellules encore collées ?