Au secours : Pb à la décongélation de cellules

[invite9dacd884]

Bonjour,

J'ai un gros souci avec mes lignées cellulaires.
Je travaille avec des cellules du cancer du col de l'utérus issues de patientes. Ma collègue a congelé ces cellules lorsqu'elles étaient en phase exponentielle en SVF et DMSO. Ces cellules sont adhérentes et le jour de la congélation étaient très belleS.
Je viens de décongeler une ampoule de chaque lignée et aucune cellule adhère, même après deux jours et mis dans un milieu avec 20% de SVF !!!! Lors de la congélation le sérum utilisé était du SVF du fournisseur PAA et malheureusement, on a changé de fournisseurs depuis et le sérum utilisé dans le milieu est actuellement du SVF Gibco.
Est-ce que ça pourrait être cette différence qui change à ce point le comportement des mes cellules ??? Je pense pas avoir traîné pour décongeler mes cellules, mais est-ce que ça pourrait expliquer ce changement d'adhérence ??

On se pose pas mal de questions avec mon équipe sur ce changement de comportement.

Est-ce que quelqu'un aurait des réponses à m'apporter et surtout des solutions ???

Merci
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[TanguyE]

Bonjour,

Il y a une rumeur au labo comme quoi PAA aurait dilué son SVF avec de l'eau et ajouté de la BSA pour donner le change (on tient ça d'un autre fournisseur, donc a prendre avec des pincettes)... Maintenant je sais pas trop si ça joue vraiment sur la congélation.

La question c'est de savoir comment vous procédez pour décongeler vos cellules. Et également s'il n'y a pas eu un soucis à la congélation.

[TanguyE]

Finalement c'est un peu plus qu'une rumeur: http://www.fishersci.fi/files/6639/G...utors__14_.pdf

[inviteb3a6feac]

Bonsoir,

Au delà de la qualité du FBS, plusieurs paramètres peuvent entrer en jeu, dont certains incompréhensibles.
La vitesse de congélation. Avez vous mis immédiatement les cellules au froid après les avoir mises en ampoule, ou avez vous eu un délai: celà peut tout tuer si le DMSO (utilisé en général entre et 1à et 20% dans les freezing media) donnant une forte pression osmotique a été trop longtemps en contact avec les cellules.
Mettez vous immédiatement les cellules au -196 ou d'abord au-80°C.
Avez fait attention au bon vissage du bouchon, pour peu de l'azote peut entre et tout défoncer durant la cryopréservation...

Si tout cela ne pose pas de problème, vous pouvez effectivement aller faire un procès à PAA.

Pour l'histoire j'utilise du FBS de Life Technologies ( =Gibco) et cela marche très bien en respectant bien les protocoles. Je me souviens avoir une fois oublié des ampoules 2 bonnes heures en salle de culture avant de les mettre au froid. Lors de la remise en culture, les cellules restaient soit quiescentes, soit étaient mortes, sans jamais adhérer. Alors qu'avec exactement le même jus de cryoconservation, avec un protocole respecté cela passe comme une lettre à la poste.

Cordialement
Nowell

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite9dacd884]

Bonjour,

La congélation a été faite par ma collègue mais il n'y a pas eu de souci. Elle fait toujours la même chose et toutes les autres cellules qu'elles décongèlent repartent sans problème.
Ce sont uniquement les miennes qui ne repartent pas. Pourtant, j'ai suivi à la lettre le protocole de décongélation : décongélation rapide de l'ampoule à 37°C puis je mets les cellules dans 5ml de SVF pur, je centrifuge et je reprends dans du milieu RPMI (leur milieu de culture) et enfi je le mets à 37°C, 5% CO2 !! Très peu avait adhéré le lendemain.

ce matin, en arrivant au labo,quelques-unes avaient adhéré durant le we et semble vouloir "pousser". Je viens de changer le milieu. J'essaye de chouchouter ces quelques cellules mais c'est pas gagné !!!

Je n'arrive pas à comprendre ce qu'il se passe. Je ne pense pas que ce soit qu'une histoire de sérum; Ce sérum je l'utilisait aussi sur les anciennes cellules et elles poussaient correctement. Je n'avais pas vu de différences majeures avec le sérum précédent (PAA). Pourquoi aurait-il un impact si important à la décongélation ?

Bref, je ne sais vraiment pas ce qu'il se passe !!!

Merci.

[TanguyE]

Bonjour,

Rien à redire sur le protocole de décongélation, c'est quasiment ce que je fais. Sans vouloir remettre en cause votre collègue, l'erreur est humaine et c'est peut être lors de la congélation qu'il y a eu un problème.

Si votre SVF fonctionne avec d'autres lignées, il n'y a pas de raisons de penser que ça vienne de là.

Je vois pas trop que dire de plus, désolé.

[invite513ac0a6]

Quand as tu fait cette décongélation? Si c'est le jour où tu as posté, te stresse pas trop pour l'instant et attend un peu. Je saurais pas trop te dire pourquoi mais ca m'est déjà arrivé que des lignées cancéreuses congelées mettent plusieurs jours à "repartir".

Par exemple ces dernières semaines sur 2 lignées différentes, pendant plusieurs jours aucune prolif et peu d'adhésion pour une lignée sensée adhérer pendant plusieurs jours, puis d'un coup c'est reparti et ca s'est mis à pousser comme du chiendent.