Bonjour,
Je dois réaliser le clonage de l'ORF OCI dans un vecteur d'expression .
Seulement les sites de restrictions présents sur mon vecteur ne sont pas présents sur l'ORF.
Pour résoudre cela, on me dit de faire un sous clonage dans pGEMT, mais je ne comprends en quoi cela peut servir !
Bonsoir
Si vos sites de restrictions sont absent de votre ORF c'est parfait! C'est la situation la plus simple qui soit.
Ce qu'il faut faire c'est simplement prendre votre ORF et l'amplifier par PCR en ajoutant aux amorces les sites de restrictions+ 6 nucléotides aléatoires
vous allez avoir quelque chose comme 5' 6xNTP--site de restriction -- 20 nucléotides de l'ORF 3'
En faisant comme cela, vous allez récupérer votre ORF borné par les sites de restriction. Vous n'aurez plus qu'à digérer et cloner directement dans votre plasmide d'intérêt.
Je suis un peu pressé et j'ai eu peu le temps d'entrer dans le détail de l'explication. Faites une recherche sur le forum, si vous le souhaitez; j'ai déjà expliqué plusieurs fois, avec des schémas, la manière de procéder.
Cordialement,
piwi
Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.
En ce qui concerne pGEMT, il s'agit d'un vecteur pensé pour y cloner directement des produits PCR sans digestion de restriction ni ajout de sites.
The pGEM®-T Vector Systems are convenient systems to clone PCR products. The pGEM®-T Vector is prepared by cutting the pGEM®-5Zf(+) Vector with EcoRV and adding a 3´ terminal thymidine to both ends. These single 3´-T overhangs at the insertion site greatly improve the efficiency of ligation of a PCR product into the plasmid by preventing recircularization of the vector and providing a compatible overhang for ligation of PCR products generated by thermostable polymerases that add a single deoxyadenosine, in a template-independent fashion, to the 3´-ends of amplified fragments. (site promega)
Mouais...
Le TA cloning fonctionne bien sur le papier, mais dans la pratique, ça dépend. Je préfère encore franchement la bonne vielle méthode à papa, au moins, ça fonctionne à tous les coups.
piwi
Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.
