clonage en phase

[cecile45]

Bonjour,
Je dois cloner un gène OCI en phase avec une His tag dans un plasmide.
Pour amplifier mon fragment OCI, je fais une PCR avec les amorces suivantes (aux quelles j'ai rajouté les sites d'enzymes de restriction car ils étaient absents de l'ORF)
5'CAT ATG ATG TCG AGC GAC GGA GGG 3'
5'CTC GAC TTA GGC ATT TGC ACT GGC 3'
Pour que mon clonage soit en phase, est ce que je dois rajouter 2 bases supplémentaires à ma première amorce, sachant que l'enzyme coupe entre le C et le A du site CAT ATG ?
En fait, je ne comprend pas très bien comment faire un clonage en phase, quelqu'un pourrait m'expliquer ?
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[piwi]

Les enzymes de restriction sont des endonucleases, si vous n'ajoutez pas quelques nucléarises devant votre site de restriction, ça ne coupera pas. Quand je faisais ce type de manip´, j'en ajoutais six.
Sinon, le clonage est très simple à comprendre, sur la papier. Votre orf doit entrer dans la même phase de lecture qu'une autre orf sur le plasmide. Il suffit de compter le nombre de nuclotides entre la fin de la première orf et l'entrée de l'insert: il faut que ce soit un multiple de trois. Si ça n'est pas le cas, il faut ajouter un ou deux nuclotides entre le site de restriction et l'ORF dans l'amorce sens.

Cordialement
Piwi

[TanguyE]

Bonjour,

Je rejoins Piwi sur le fait que les enzymes de restriction sont des endonucléases. Allez faire un tour sur cette page pour voir quel est le nombre de nucléotides à ajouter avant vos sites de restriction pour que la réaction soit optimale.

Pour contrôler que mes clonages soient en phase, j'utilise Serial cloner (gratuit sous windows) pour faire mes PCR, clonages et controles in silico avant de commander mes primers.

[cecile45]

Je suis désolé mais je ne comprends pas très bien, est ce possible de m'expliquer sur cet exemple ? je ne comprends pas comment voir si on est bien phase ?
Je dois cloner l'OFR OCI dont la séquence se trouve dans le document en pièce jointe dans le plasmide.
Pour amplifier mon fragment j'utilise les amorces
5' CAT ATG ATG TCG AGC GAC GGA GGG 3' (ajout du site Nde1)
5' CTC GAG TTA GGC ATT TGC ACT GGC 3' (ajout du site Xho1)
Les enzymes coupent
Nde1 CA*T ATG
Xho1 C*TC GAG
Combien de bases dois je rajouter à mes amorces pour que mon clonage soit en phase ?
Je suis vraiment perdue et je ne peut pas continuer mon exercice sans ça^^

[A voir en vidéo sur Futura]