Compétition ligand chaud/froid et courbe de Michaelis

[invite91c8de42]

Bonjour,
Voici mon problème:
Je souhaite déterminer le kd et le Bmax d'un récepteur pour son ligand. Pour cela je dispose d'un tableau de mesure de radioactivité dans lequel le ligand marqué (radioactif) ne varie pas tandis que le ligand froid augmente (de 10-¹² à 10^-6M). Avec ces valeurs, je trace ma courbe d'inhibition compétitive et je retranche (grâce à graphpad prism) la liaison non spécifique correspondant à l'asymptote horizontale (du bas) afin d'avoir uniquement la liaison spécifique.

Bref et donc à partir de là il faut que je trace la courbe de saturation correspondant à la liaison spécifique en M (tenant compte de la dilution isotopique) sur le ligand total (froid + chaud).

J'ai trouvé sur un site qu'il fallait multiplier le coefficient de dilution isotopique avec la valeur (en M) de liaison spécifique. Le problème est que le coefficient de dilution isotopique augmente énormément (de 1 à 100000 environ) et que pour des valeurs proches de mon asymptote horizontale, les valeurs deviennent absurdes (négative ou proche de zéro alors qu'elles devraient se stabiliser ou augmenter légèrement).
Je pourrais évidemment retrancher une valeur moins importante pour ma liaison non spécifique, "au hasard", mais ça ne me parait pas du tout scientifique...

Si vous avez une solution, je vous en serez grandement reconnaissant!
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[invite91c8de42]

Bonjour, je me permet d'auto-répondre à mon sujet parce que je pense avoir un bout de réponse.

Ce que je demandais n'avais en réalité aucun sens scientifique. En effet, pour avoir accès à ces valeurs (Kd et Bmax) à partir de cette technique, le résultat ne peut qu'être une approximation. En effet, le résultat peut-être considéré comme proche pour des valeurs éloignées de l'asymptote horizontale mais l'erreur devient majeure à proximité de celle-ci.
Pour calculer le Kd et le Bmax, le mieux étant de faire non pas un test d'inhibition avec ligand chaud et ligand froid mais un test de liaison avec une concentration connue de ligand chaud qui augmente.

ps: je tiens à remercier la personne qui m'a posé ce problème et m'a permis ainsi d'approfondir énormément ces notions (non non ce n'est pas de l'ironie... ... ou pas)

[invite74b9e03b]

Salut,

En effet il faut que tu fasses une courbe de saturation. (LR) Ligand récepteur lié, en fonction de d'une concentration variable de ligand chaud, gamme de concentration qui variera autour du Kd théorique (ou si tu ne le connais pas: une large gamme). Comme tu l'a fais tu répéteras l'expérience, en ajoutant du ligand froid en large excès à ta gamme de ligand chaud afin de déterminer la liaison non spécifique. De là, tu retranches ta liaison non spécifique à la liaison totale pour obtenir la liaison spécifique. La valeur maximale de la liaison spécifique constituera ton Bmax (nombre de site de fixation), Le Kd approximatif est la concentration de Ligand correspondant à la moitié de ton Bmax. Enfin il ne s'agit que de valeurs approximatives. Si tu veux des valeurs plus précises je te conseil de linéariser ta courbe en utilisant la représentation de Scatchard: (LR)/Llibre= f (LR) (LR étant toujours ta valeurs de ligand lié). Il est rare que les points fit parfaitement alors il faut faire une régression linéaire. L'équation de la droite étant ax+b: a=-1/Kd et la valeur de x pour ax+b=0 est égale au Bmax.

Camu