Bonjour à vous tous,
Je me permets d'ouvrir un topic car après un TP de bio je butte un peu sur des calculs d’activités enzymatiques. Je pense être bon mais certains points me retourne le craneet je change d'avis toutes les 10 minutes
Du coup si vous pourriez me donner votre avis ça m'éviterait d'exploser!
Il s'agit d'un TP d'écotox, on a exposé des organismes (poissons) à différents polluant dilués dans le milieu. Ensuite on a récupéré différents organes et on dose l'activité enzymatique : acétylcholinestérase et phosphatase acide. Il y a donc un protocole différent pour chaque enzyme
Alors on va commencer par la partie qui me semble OK (acétylchol) :
Voici les manipes:
-exposition puis prélèvements des tissus et pesées
-réalisation d'un homogénat dans du tampon
-réalisation du milieu réactionnel : tampon+substrat+homogénat
-suivit de la DO pendant 3minutes toutes les 30s
Et voici ma méthode de calcul:
-Je parts de la loi de Beer-Lambert : DetltaDO=e.l.deltaC
Avec e=extinction molaire, l=longueur cuve (1cm)
-l'activité enzymatique étant une variation de concentration dans le temps, j'isole detlaC et je rapporte /min
deltaC=(deltaDo/delta t)*60*1/e
J'obtiens donc l'activité du milieu réactionnel en moles/min
-Après je dois passer l'activité en moles/min/mL d'homogénat. A partir de là il me semble que comme l'activité mesurée dans le milieu réactionnel est entièrement du au volume d'homogénat dans ce milieu je peux donc dire : activité milieu réactionnel = activité du volume d'homogénat du milieu réactionnel (j'ai quand même un petit doute là!). J'ai donc:
deltaC=(deltaDo/delta t)*60*1/e*1000/Volume d'homogénat dans le milieu réac
Ce qui me donnerait activité en moles/min/mL d'homogénat
-Après je dois passer en moles/min/mg de tissus. Donc je multiplie le tout par le volume total d'homogénat puis je divise par la masse de tissus
deltaC=(deltaDo/delta t)*60*(1/e)*(1000/Volume d'homogénat dans le milieu réac)*(Vol tot homo/masse tissus)
-Après je dois passer en moles/min/mg de protéines dans l'homogénat. Je reprends donc la formule exprimée en moles/min/mL d'homogénat et je divise par la concentration en prot/mL d’homogénat (donnée acquise par dosage de prot)
Maintenant le dosage de l’activité PAC :
Pour le dosage de la PAC le protocole diffère légèrement:
-de nouveau réalisation d’un homogénat à partir d’une masse donnée de tissus + tampon
-réalisation d’un homogénat dilué : dilution au 10ème
-réalisation du milieu réactionnel : substrat+tampon+homogénat dilué
-incubation 30min puis arrêt de la réaction et dosage au spectro
-en parallèle une courbe étalon est réalisé. Elle permet le passage de la DO à l ‘activité enzymatique en unité Sigma/mL
Méthode de calcul :
-Dans un premier temps je passe de la DO à l’activité en unité Sigma/mL grâce à la droite étalon.
-Puis je convertie en U/L grâce au coefficient (16.7) fournit dans le protocole.
-C’est à partir de là que je commence à m’embrouiller (et c’est vraiment peu dire !!!)
-J’obtiens donc une activité de mon milieu réactionnel en U/L. Après recherches et si j’ai bien compris U s’exprime en µmoles/min (est-ce exacte car si je me plante déjà là...). Donc l’activité en U/L équivaut à µmoles/min/L. De cette conclusion je ressorts que l’activité d’un L de milieu réactionnel et la même que n’importe quel volume de milieu réactionnel aux mêmes concentrations de chaque constituant (c’est là que change tout le temps d’avis, un coup je me dis oui c’est bon et la minute d’après je n’en suit plus du tout convaincus...) et que donc comme l’activité du milieu est issue uniquement de l’homogénat je pose que activité du milieu en µmoles/min/L = activité de n’importe quel milieu aux même proportion = volume d’homogénat dans le milieu.
C’est vraiment sur ce point que j’aimerais avoir vos corrections.
Après je dois de nouveau ramener l’activité en moles/min/ml d’homo puis /mg de tissus puis /mg de protéines. Donc je réutilise les mêmes formules que pour le premier protocole en tenant compte de la dilution lors de la réalisation de l’homogénat dilué.
Voilà je crois que c’est tout ^^ désolé d’avoir été « long » mais je pense que comme ça je suis le plus claire possible.
Pour le point qui me pose problème je n’arrive vraiment pas à être fixé si l’activité de deux « mélanges » aux mêmes proportions sera différents ou non, et si le fait de prendre une fraction d’un « mélange » modifie l’activité de la fraction prélevée. J’ai l’impression que si on rapport les activités des deux mélanges /mL elle sera la même mais que les activités « brutes » c’est à dire les quantités de substrat consommées en un même temps par un litre ou un mL de mélanges ne seront forcément pas égales. Enfin vos lumière me seront vraiment utiles pour mon équilibre mentale
J’ai un peu de mal à être claire sur comment je vois la chose et sur ce qui me pose vraiment problème, je pense car ce n’est pas très claire pour moi et j’apprécierais beaucoup d’avoir une explication.
Merci d’avoir pris le temps de me lire et pour votre aide
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