Bonsoir,
j'ai réalisé un tp la semaine dernière pour lequel je dois rendre un compte rendu,mais il y a un point que je n'arrive pas à éclaircir.
Je vais essayer de résumer tout en donnant le max d'info pour que ce soit clair et compréhensible.
Dans le tp on nous donne un plasmide recombinant,un avec une séquence d'ADN qu'on appelle Dsred,l'autre GFP.Le but est de le différencier par différent moyen PCR,digestion enzymatique et électrophorèse.
Nous faisons donc une PCR avec notre plasmide contenu dans deux tubes eppendorf et on y ajoute les oligonucléo de la DsRed et de la GFP dans chacun des tubes,forcément selon le plasmide qu'on aura il n'y a qu'une seule PCR qui va fonctionner.
Puis après on décide de faire une carte de restriction,en faisant une digestion enzymatique par l'enzyme de restriction xho1,cette enzyme se trouve de base dans le plasmide recombinant et aussi dans la séquence de l'ADN de la GFP mais pas dans celui de la Dsred.
Bon déjà est ce que c'est assez clair ^^' ?
Si oui suite à ces deux manipulations on a fait une électrophorèse pour visualiser les résultats.
Déjà je voulais savoir si la carte de restriction suite à la digestion enzymatique était donné par l'électrophorèse ?
Si oui j'ai un petit problème,avec notre électrophorèse on a ajouter un ladder ( une gamme étalon pour visualiser la taille de nos fragments ) si la carte de restriction est bien donné par l'électro je visualise que mon deuxième site de coupure Xho1 se trouve entre 800 et 1000 paires de bases.
Alors que dans la sequence d'ADN de la GFP on nous dis que le gène se trouve à la paire de base n°421,en ajoutant les paires de bases entre lesquelles mon gène code je trouverais un site de restriction à peu près a 651 paires de bases..
Du coup je comprend vraiment pas.Le gène total de la GFP fait 717 paires de bases,si le deuxième site de restriction Xho1 était à mettre dans sa totalité il serait à 947 paires de bases,ce qui collerait plus au niveau de la visualisation par electro,mais du coup j'aurais un problème pour recalculer la taille totale du plasmide recombinant..
J'espère avoir été assez clair,je pense que c'est vraiment très dur de me comprendre sans avoir le tp sous les yeux ou que je vous l'exprime à vive voix mais malheureusement c'est impossible.Merci d'avance.
Cordialement
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