[L1 BIO] TP Biologie moléculaire

[Canap]

Bonsoir,

j'ai réalisé un tp la semaine dernière pour lequel je dois rendre un compte rendu,mais il y a un point que je n'arrive pas à éclaircir.

Je vais essayer de résumer tout en donnant le max d'info pour que ce soit clair et compréhensible.

Dans le tp on nous donne un plasmide recombinant,un avec une séquence d'ADN qu'on appelle Dsred,l'autre GFP.Le but est de le différencier par différent moyen PCR,digestion enzymatique et électrophorèse.

Nous faisons donc une PCR avec notre plasmide contenu dans deux tubes eppendorf et on y ajoute les oligonucléo de la DsRed et de la GFP dans chacun des tubes,forcément selon le plasmide qu'on aura il n'y a qu'une seule PCR qui va fonctionner.

Puis après on décide de faire une carte de restriction,en faisant une digestion enzymatique par l'enzyme de restriction xho1,cette enzyme se trouve de base dans le plasmide recombinant et aussi dans la séquence de l'ADN de la GFP mais pas dans celui de la Dsred.


Bon déjà est ce que c'est assez clair ^^' ?

Si oui suite à ces deux manipulations on a fait une électrophorèse pour visualiser les résultats.

Déjà je voulais savoir si la carte de restriction suite à la digestion enzymatique était donné par l'électrophorèse ?

Si oui j'ai un petit problème,avec notre électrophorèse on a ajouter un ladder ( une gamme étalon pour visualiser la taille de nos fragments ) si la carte de restriction est bien donné par l'électro je visualise que mon deuxième site de coupure Xho1 se trouve entre 800 et 1000 paires de bases.
Alors que dans la sequence d'ADN de la GFP on nous dis que le gène se trouve à la paire de base n°421,en ajoutant les paires de bases entre lesquelles mon gène code je trouverais un site de restriction à peu près a 651 paires de bases..

Du coup je comprend vraiment pas.Le gène total de la GFP fait 717 paires de bases,si le deuxième site de restriction Xho1 était à mettre dans sa totalité il serait à 947 paires de bases,ce qui collerait plus au niveau de la visualisation par electro,mais du coup j'aurais un problème pour recalculer la taille totale du plasmide recombinant..


J'espère avoir été assez clair,je pense que c'est vraiment très dur de me comprendre sans avoir le tp sous les yeux ou que je vous l'exprime à vive voix mais malheureusement c'est impossible.Merci d'avance.

Cordialement
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[slm33]

Bonjour,
tu ne serais pas à luminy par hasard

[Canap]

Bonjour,
Non mais je suis dans l'académie de Aix-Marseille,du coup on a du avoir le même tp ,vous auriez la possibilité d'éclaircir ce point avec moi par hasard ?

[Guillaume69]

Bonsoir,

Attention aux imprecisions et erreurs de compréhension de ton TP.

Nous faisons donc une PCR avec notre plasmide contenu dans deux tubes eppendorf et on y ajoute les oligonucléo de la DsRed et de la GFP dans chacun des tubes,forcément selon le plasmide qu'on aura il n'y a qu'une seule PCR qui va fonctionner.

Tu ne "fais pas une PCR et tu ajoute les primers dsred ou gfp".
Tu fais 2 PCR à partir chacun des 2 plasmides, l'une pour amplifier la sequence dsred, l'autre pour amplifier la séquence gfp.

Puis après on décide de faire une carte de restriction,en faisant une digestion enzymatique par l'enzyme de restriction xho1,cette enzyme se trouve de base dans le plasmide recombinant et aussi dans la séquence de l'ADN de la GFP mais pas dans celui de la Dsred.

L'enzyme est dans ton plasmide ?
Non. Il n'y a aucune enzyme dans un plasmide (elle se cacherait où, entre les deux brins d'ADN ?), il n'y en a pas non plus dans le tube contenant le plasmide, sinon il serait déjà digéré. Il n'y a pas non plus la séquence codant pour l'enzyme.
Il y a des sites de restrictions de ton enzyme.

Ce que je dis te parait peut-être banal, mais crois-moi tout le monde ne le comprends pas et il est très important que tu ne fasses pas croire au lecteur de ton compte-rendu que tu ne sais pas du tout ce que tu fais en évitant des formulations maladroites et peu précises.

Déjà je voulais savoir si la carte de restriction suite à la digestion enzymatique était donné par l'électrophorèse ?

Non !
La digestion te donne des fragments d'ADN. L'electrophorèse les classe selon leur taille. Le résultat du gel d'electrophorèse te donne donc seulement des bandes, chaque bande correspond à des fragments de plasmides d'une taille donnée.
La carte, c'est l'interprétation que tu en fais, c'est-à-dire la disposition des différents sites de restrictions sur ton plasmide avec la distance séparant chacun des sites que tu as placé.

Par exemple, si ton plasmide fait 3000pb et que tu trouves :
une bande intense à 800 pb (=2 fragments)
une bande à 700pb
une bande à 600pb
une bande à 100pb
Tu en déduis qu'il y a eu 5 fragments issus de ta digestion donc 5 sites sur ton plasmides, séparés par 100, 600, 700, 800pb et encore 800pb ... Mais ça ne te donne pas l'ordre selon lequel ils sont placés les uns par rapport aux autres.... Tu n'as donc toujours pas la carte de ton plasmide avec cette simple information.

je visualise que mon deuxième site de coupure Xho1 se trouve entre 800 et 1000 paires de bases.

Donc non, tu ne peux pas visualiser ça directement...
Ce que tu appelles "deuxième site de coupure", c'est donc probablement une deuxième bande, qui a une taille située entre 800 et 1000pb !

Alors que dans la sequence d'ADN de la GFP ...

Oui, dans la séquence d'ADN de la GFP, qui n'est que l'insert de ton plasmide... Il ne faut pas oublier tout le reste

[A voir en vidéo sur Futura]

[Canap]

Bonsoir,

Ok je comprends mieux les choses,surtout pour le site de restriction ,ca s'annonce pas bon pour le tp.Je n'avais pas remarqué a quel point j'ai pu être imprécis,merci beaucoup.

Cordialement

[Guillaume69]

Je pense pas qu'un TP soit déterminant dans une UE (encore moins pour un semestre) ... L'important c'est d'apprendre à être précis et à dire ce que tu veux dire, ni plus ni moins... Surtout pour tes partiels.

Bonne continuation

[slm33]

Désolé, je n'étais pas en TP. Par contre j'ai des diapos mises en ligne sur ce qu'il fallait savoir avant d'aller en TP. Je ne sais pas si vous avez la même chose. Si tu veux je peux te les envoyer.

Malheureusement guillaume, le TP compte pour beaucoup (dans les 30% de la note finale et il faut rédiger environ une dizaine de pages..)