Mesure de l'activité d'exocytose de la HRP chez l'amibe (Niveau L2)

[Marly22]

Lors d'un TP de biologie cellulaire nous avons mesuré l'activité d'ENDOCYTOSE de la HRP par l'amibe en faisant un suivi spectrométrique de la HRP des cellules d'amibe préalablement lavés, centrifugés, lysés en y ajoutant le substrat de la HRP : le TMB

Par ailleurs il nous ai demandé de schématiser clairement comment ferions nous pour mesurer l'activité d'exocytose de la HRP chez l'amibe ?

- J'ai d'abord pensé à :

- Prendre les cellules qui ont endocytés la HRP de l'expérience 1 avant d'être lysées
- Suspendre ces dernières dans un Tampon adéquat à l'exocytose
- Centrifugation
- Prélever et Réserver le surnagent
- Ajouter le TMB
- ajouter l'HCL pour stopper la réaction
- Doser la solution au spectrophotomère

Ce protocole est il correct ? Faudrait il doser le calcium ?

Les pages internet pour ce genre de dosage me dirige vers des techniques trop compliqués et non abordés à notre niveau.


Merci d'avance
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[camulus]

Salut,

Ton protocole est tout à fait juste. Peut-être une petite étape de lavage à 4°C avant de les suspendres dans ton tampon d'exocytose afin d'éliminer des HRP qui serait associées de manière non spécifique aux cellules. (Et à 4°C pour bloquer l'exocytose afin de ne pas démarrer l'exocytose avant le lavage). J'ajouterais même en contrôle un dosage de la LDH (enzyme cytosolique) afin de montrer que la présence de HRP dans le milieu est due à des évènements d'excrétion et non de lyse.

Pourquoi désires-tu doser le calcium ?
(Pour la mesure du calcium, c'est assez simple: il éxiste des sondes fluorescentes dont la les spectres d'emission changent lorsque du calcium s'y fixe.)

Camu

[Marly22]

J'ai pensé au dosage du calcium parce que l'exocytose est parfois associé à la variation de la concentration du calcium au niveau synaptique par exemple mais c'est peut être un raccourci et une fausse route dans le cas de l'amibe.

Merci beaucoup pour votre aide !

[camulus]

C'est vrai les événements d'exocytoses sont souvent (si ce n'est pas toujours) associés à une augmentation transitoire de calcium intracellulaire. Mais l'inverse n'est pas toujours vrai, donc ce n'est pas parce qu'il y a une augmentation de la concentration de calcium qu'il y a eu exocytose.

Camu

[A voir en vidéo sur Futura]

[katsiah]

Bonjour !
Le protocole semble correcte , pour préciser j'ai le même TP et avec mon binôme on a trouvé le même protocole
J'ai juste une question a laquelle on arrive pas à répondre :
En faisant une cinétique d'endocytose de 0 à 60 min , on a tracé une courbe DO en fonction du temps et nous devons calculer la vitesse initiale d'endocytose a partir du graphe puis détailler les calcules
je sais que la Vi = la pente / ε * l
le problème est comment déterminer la valeur d'epsilon ?
Merci d'avance