purification d'ADN sur gel
Bonsoir a tous,
J'ai un problème avec la purification de l'ADN excisé à partir du gel. le volume d'ADN que je récupérè après élution est très faible sachant que j'utilise un it de purification et que le volume du tampon d’élution que j'utilise est choisi en fonction de l’intensité de la bande de départ . je laisse 10 minutes avant la centrifugation. Quelqu'un pourrait m'aider?
merci d'avance
Bonjour,
Tout dépend de ce que tu appelles faible. Qu'est-ce que tu dépose (plasmide, PCR...). Quelle quantité originale? Quelle application derrière?
Bonjour,
Difficile comme cela. Quel kit? Quel fournisseur?
L'hypothèse la plus plausible est l'assèchement de la colonne pendant le temps d'attente. Donc deux solutions, diminuer le temps d'attente, ou placer la colonne dans une atmosphère à haute teneur d'humidité.
Bonjour biseibutsu,
Il s'agit en fait du kit promega (wizard sv). Ils indiquent 1min d'incubation à température ambiante mais j'incube pendant 5min environ en croyant que ça va améliorer l’élution.
Merci de ton aide.
Bonjour TanguyE,Envoyé par TanguyE
je dépose des produits PCR que je purifie avec le kit promega à partir du gel. les intensités des bandes des produits PCR diffèrent.Il y a des bandes qui présentent une intensité moyenne ou faible donc je minimise le volume du tampon de dilution pour que ça ne soit pas trop dilué. Le problème c'est que le volume du produit de purification que j'obtiens est très petit. Les produits purifiés seront clonés.
Pour les quantités originales ça varie entre les 400 et 1800ng/ul mais la quantité ne reflète pas toujours l'intensité.
Si c'est pour du clonage, une petite quantité d'ADN est suffisante.
En général je fait 3 PCR en parallèle avec le même amplicon que je pool. Je fait migrer 100µL sur gel (en scotchant mon peigne pour faire des grands puits). Après purif, j'ai en moyenne 30µL entre 5 et 15ng/µL ce qui me suffit largement pour faire mes clonages.
Attention à ne pas aller en dessous du volume minimum de tampon d'élution qui devrait être écrit quelque part dans ton manuel. Essaye de chauffer le tampon d'élution à 37°C, et ne dépasse pas les 2 min d'incubation pour ne pas que ta colonne sèche.
C'est tout ce qui me vient à l'esprit pour l'instant.
Merci infiniment pour tes conseils TanguyE mais juste une question, que veux tu dire par "scotcher le peigne pour faire des grands puits"?encore merci beaucoup.
Pour les bandes que j'excise à partir du gel,parfois je ne les purifie pas directement pour une raison ou une autre et je les laisse à -20.Penses-tu que ça peut influencer la qualité de la purification plus tard?
merci infiniment
Un puits normal sur un peigne fait environ 5mm de large, et entre chaque puits il y a un espace vide qui permet de séparer les puits. Je mets un petit morceau de scotch sur mon peigne ce qui me permet de faire la jonction entre deux dents du peigne pour avoir un double puits.scotcher le peigne pour faire des grands puits
Non je ne pense pas, j'ai déjà laissé mes morceaux de gel à 4°C sur le weekend et je n'ai pas vu de différence flagrante.Pour les bandes que j'excise à partir du gel,parfois je ne les purifie pas directement pour une raison ou une autre et je les laisse à -20.Penses-tu que ça peut influencer la qualité de la purification plus tard?
Pour la conservation des blocs de gel je ne parle pas de quelques jours mais je parle plutôt de mois
Merci beaucoup.
Au labo, on préfère quand tout est frais. Surtout pour un clonage difficile. On fait donc tout sur la journée (avec la ligation parfois sur la nuit...).
